秦智鋒，劉建利，盧體康，林慶燕，呂建強，曹琛福，阮周曦，曾少靈，陳書琨，廖立珊，孫 潔，張彩虹，花群義

（1.深圳出入境檢驗檢疫局，廣東深圳 518001；2.深圳市外來有害生物質(zhì)檢測技術研發(fā)重點實驗室，廣東深圳 518045）

新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）屬于副黏病毒科（Paramyxoviridae）副黏病毒屬I型（APMV-1）病毒，該病毒主要危害雞、珠雞和火雞，能夠在被侵襲的雞群中迅速傳播。NDV被我國列為一類傳染病，也是世界動物衛(wèi)生組織（OIE）須呈報的疫病，是國際動物產(chǎn)品貿(mào)易中重點檢查的重大動物疫病。根據(jù)病毒株致病力的差異，將NDV分為強毒力型、中等毒力型及弱毒力型。NDV中強毒株在雞群中傳播迅速，危害嚴重[1]；而弱毒株僅引起雞群呼吸道感染和產(chǎn)蛋量下降，多與其他疾病共同發(fā)病而造成一定的危害[2]。因此，建立鑒別NDV并有效區(qū)分中強毒株和弱毒株的新型快速分子生物學檢測方法成為迫切要求，對有效控制疫情、降低經(jīng)濟損失具有重要意義。

鎖核酸（Locked nucleic acid，LNA）是一種新型的寡核酸衍生物，與TaqMan探針相比，具有兩個明顯的優(yōu)點：一是可增強熱穩(wěn)定性和雜交的特異性，二是LNA探針長度較短，可增加設計的靈活性。

本研究利用LNA探針技術，針對中強毒株和弱毒株特異序列分別設計了堿基鎖定的LNA探針，極大地提高了探針的Tm值和特異性，并建立了同時鑒別診斷NDV中強毒株與弱毒株的雙重熒光定量鎖核酸RT-PCR（Duplex LNA rRT-PCR）檢測方法。

1 材料和方法

1.1 病毒與血清 NDV標準強毒株F48E9、中等毒力I系疫苗（Mukteswar株）購自中國獸藥監(jiān)察所；NDV標準弱毒株Ⅱ系（B1株）、Ⅲ系（F株）、IV系（Lasota株）和Clone-30弱毒疫苗株均由深圳市獸醫(yī)防疫監(jiān)督所饋贈；NDV，禽流感病毒（AIV）H5、H7、H9標準陽性血清，均購自哈爾濱獸醫(yī)研究所；9日齡SPF雞胚購自北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司。

1.2 主要試劑 AgPath-IDTMOne-Step RT-PCR Kit購自美國ABI公司；Qiagen Viral RNA Mini Kit購自Qiagen公司；美國農(nóng)業(yè)部推薦的副粘病毒I型（APMV-1）實時熒光RT-PCR（APMV-1-rRT-PCR）檢測引物探針和NDV中強毒株（vNDV）引物探針[3]由上?；倒竞铣?。

1.3 樣品的采集與檢測 采集2003年以來深圳地區(qū)雞場樣品進行NDV監(jiān)測。每個雞場分大、中、小3個采樣群采樣。每個采樣群分別采集喉頭棉拭子和泄殖腔棉拭子30份，每3份合成一個混合樣，即每個雞場采集30份混合樣品，于當日送至實驗室進行檢測。樣品到達實驗室后，采用美國農(nóng)業(yè)部推薦的APMV-1-rRT-PCR進行篩選檢測[3]。

1.4 NDV株的分離與鑒定 對APMV-1-rRT-PCR篩選陽性的樣品，按照《新城疫診斷技術》（GB/T 16550-2008）進行雞胚分離與鑒定。將樣品處理后接種9日齡SPF雞胚，接毒3 d后，無菌收獲尿囊液進行鑒定。

參照OIE手冊中推薦的標準[4]，采用標準的血凝方法（HA）程序進行檢測。以血凝價超過≥23初步判定為具有血凝活性。

將具有血凝性的抗原統(tǒng)一稀釋成4血凝單位的溶液，分別與NDV標準陽性血清，AIV H5、H7、H9亞型標準陽性進行血凝抑制試驗（HI）。以血凝抑制價≥23判定為同血清亞型一致的亞型抗原。

1.5 duplex LNA rRT-PCR檢測方法的建立

1.5.1 引物與探針設計采用bioEdit（7.0.9.0）軟件，將GenBank中NDV主要代表性強毒力病毒株、中等毒力病毒株和弱毒力病毒株的F基因全序列，以ClusalW方式進行排列，選取F基因裂解位點兩端保守區(qū)域設計簡并引物，選取裂解位點序列設計鑒別診斷簡并探針。中強毒株探針和弱毒株探針均使用了簡并堿基脫氧次黃嘌呤（I）。引物與探針序列見表1，中強毒株探針的5'端用FAM標記，弱毒株探針用HEX標記，探針的3'端用BHQ基團淬滅。

1.5.2 duplex LNA rRT-PCR檢測方法建立參照QIAamp Viral RNA Mini Kit說明書操作，于全自動核酸抽提工作站中抽提中強毒株5株（強毒株F48E9、中等毒株I系疫苗、vNDV-YF、vNDV-HB和vNDV-KD）、弱毒株 6株（Ⅱ系、Ⅲ系、IV系、Clone-30、aNDV-YF和aNDV-RR）和陰性對照尿囊液中病毒核酸。

參照ABI公司AgPath-IDTMOne-Step RT-PCR Kit操作說明書配制熒光RT-PCR反應液。進行實時熒光PCR擴增，反應程序如下：50℃30 Min，95℃10m in；95℃ 10 s、55℃ 30 s、72℃ 30 s，5個循環(huán)；95℃10 s、60℃40 s，35個循環(huán)，設置60℃時同時收集FAM和HEX兩種熒光。

1.5.3 Duplex LNA rRT-PCR與Taq Man rRT-PCR檢測方法靈敏度比較選取強毒株F48E9和弱毒株IV系疫苗尿囊液，10倍系列稀釋成1×10-1～10-10等10個稀釋度，用EZ1抽提核酸，按照所建立的方法進行靈敏度試驗。同時采用美國農(nóng)業(yè)部推薦的Taq-Man-APMV-1-rRT-PCR檢測方法和TaqMan-vNDV-rRT-PCR檢測。測定duplex LNA rRT-PCR和Taq-Man rRT-PCR檢測NDV的靈敏度。

表1 NDV中強毒株與弱毒株鑒別引物與探針Table 1 Primers and probes for pathotyping of NDV

1.5.4 Duplex LNA rRT-PCR檢測方法特異性試驗采用duplex LNA rRT-PCR方法，檢測中強毒株和弱毒株均同時收集了FAM和HEX兩種熒光，來檢測兩個探針的特異性。

利用duplex LNA rRT-PCR檢測方法，對實驗室保存的雞肉正常組織、雞血清樣品、火雞肌肉組織、鴿組織、豬肉組織、正常雞胚尿囊液、AIV H1N1、H3N2、H5N1、H7Nx、H9N2和傳染性支氣管炎病毒、傳染性法氏囊病病毒、馬立克病毒等其他家禽病毒和大腸桿菌、沙門氏菌、單增李氏特桿菌等細菌共22份非NDV陽性樣品進行檢測，進一步確定所建立方法的特異性。

1.6 臨床樣品檢測 對2010年～2011年深圳雞場新城疫普查監(jiān)測的樣品312份混合棉拭子進行duplex LNA rRT-PCR檢測，同時按照美國農(nóng)業(yè)部推薦的標準TaqMan-APMV-1-rRT-PCR進行檢測，按照出入境行業(yè)標準《新城疫中強毒株檢測方法熒光RT-PCR法》 （SN/T 1686-2005）進行TaqMan-vNDV-rRT-PCR檢測。確定所建立方法的可行性。

2 結果

2.1 NDV的檢測與鑒定結果 自2003年以來，共采集NDV監(jiān)測混合棉拭子樣品近6 000份。Taq-Man-APMV-1-rRT-PCR檢測結果陽性的共有121份。對2004年以前的篩選陽性樣品，全部采用雞胚進行病毒分離后進行HA和HI鑒定。2003年和2004年共鑒定出NDV中強毒株3株，弱毒株2株，由哈爾濱獸醫(yī)研究所進行毒力鑒定。詳細檢測結果見表2。最終分離出5株NDV，用于duplex LNA rRTPCR檢測方法建立以及對強弱毒株檢測的特異性分析。對于2005以后的樣品，采用國家出入境行業(yè)標準《新城疫中強毒株檢測方法熒光RT-PCR法》（SN/T 1686-2005）進行中強毒株鑒定。

表2 2003年～2004年分離的NDV毒株Table 2 Isolation of NDV during 2003-2004

2.2 Dup lex LNA rRT-PCR檢測方法的建立結果在25μL反應體系中，加入分別用FAM標記的中強毒株探針和HEX標記的弱毒株探針，在設定的反應條件下進行duplex LNA rRT-PCR鑒別檢測。在陰性對照成立的情況下，F(xiàn)AM標記的中強毒株探針特異性地實時擴增出5株不同中強毒株，HEX標記的弱毒株探針特異性地實時擴增出6株不同弱毒株，兩者之間無交叉反應（圖1）。

圖1 11株NDV株duplex LNA rRT-PCR鑒別檢測結果Fig.1 The differentiation of 11 NDV strainsw ith duplex LNA rRT-PCR

2.2.1 Duplex LNA rRT-PCR與Taq Man rRT-PCR檢測方法靈敏度比較結果將10倍系列稀釋的F48E9和IV系疫苗同時進行duplex LNA rRT-PCR單重檢測靈敏度測定和TaqMan rRT-PCR靈敏度測定。測定結果顯示，duplex LNA rRT-PCR單重檢測F48E9的靈敏度為 10-5（圖2），而TaqMan-vNDV-rRT-PCR檢測F48E9的靈敏度為 10-6（圖3）。通過計算，F(xiàn)48E9毒株 10-6稀釋度相當于 1個 EID50[3]，而 duplex LNA rRT-PCR檢測方法單重檢測強毒株F48E9的靈敏度為10個EID50。Duplex LNA rRT-PCR檢測強毒株靈敏度要比TaqMan-vNDV-rRT-PCR檢測方法的靈敏度低10倍，而且熒光增幅也有一定的差距。Duplex LNA rRT-PCR單重檢測LaSota的靈敏度為 10-6（圖4），而TaqMan-APMV-1-rRT-PCR檢測 LaSota的靈敏度為10-7（圖5）。通過計算，LaSota毒株10-7稀釋度相當于10個EID50[3]，而duplex LNA rRT-PCR單重檢測弱毒株 LaSota的靈敏度為 0.1個 EID50。Duplex LNA rRT-PCR檢測弱毒株靈敏度要比Taq-Man-APMV-1-rRT-PCR檢測方法的靈敏度低10倍，并且熒光增幅也有一定的差距。

圖2 Duplex LNA rRT-PCR單重檢測F48E9強毒株的靈敏度測定結果Fig.2 Sensitivity of duplex LNA rRT-PCR for F48E9 strain detection

2.2.2 Duplex LNA rRT-PCR檢測方法特異性試驗結果在對5株強毒株和6株弱毒株建立duplex LNA rRT-PCR檢測方法過程中，同時收集了FAM和HEX兩種熒光，顯示兩個探針的特異性強，相互之間無交叉反應（圖1）。通過對22種非NDV陽性樣品的檢測，結果全部為陰性（圖略），所建立的NDV duplex LNA rRT-PCR檢測方法的特異性為100%（22/22）。表明該方法特異性強，與其他檢測對象無交叉反應。而TaqMan-APMV-1-rRT-PCR方法對11個NDV株進行檢測時，無法檢測到clone 30毒株，即使將退火溫度降至45℃，仍然顯示為陰性結果。

2.2.3 臨床樣品檢測結果針對2010年~2011年312份混合棉拭子樣品進行duplex LNA rRT-PCR檢測和TaqMan-rRT-PCR檢測，結果顯示兩者的一致性完全相符。共篩選檢測出NDV中強毒株樣品2份，NDV弱毒株樣品3份。

3 討論

在探針的設計過程中，本實驗采用了簡并堿基I，既保證了擴增時有一定的優(yōu)選順序，又有效避免了漏檢。堿基I稱作脫氧次黃嘌呤，是一個自然存在的堿基，雖然不是真正意義上的通用堿基N，但當與其它堿基結合時，會比其它錯配堿基相對更穩(wěn)定。脫氧次黃嘌呤與其它堿基的結合能力為dI∶dC>d I∶dA>dI∶dG>d I∶dT。鑒于裂解位點探針所先的位置均有4個堿基存在，但堿基G的數(shù)量最多，堿基T的數(shù)量最少，為了更好地實施檢測，所以選擇了I而非N進行探針的設計。堿基I在DNA聚合酶的催化下，脫氧次黃嘌呤首選與dC結合，其次再與A或G結合，最后與T結合，既保證了親和性不同，又避免了漏檢現(xiàn)象的發(fā)生。

本研究采用LNA探針的方法，在NDV裂解位點設計了針對中強毒株的LNA探針和針對弱毒株的LNA探針，使用同一引物來進行擴增，建立了同一反應中同時鑒別檢測NDV毒力的雙重實時熒光RT-PCR檢測方法。由于采用了雙重熒光標記探針檢測，而且探針中采用了簡并探針的方法，中強毒株探針和弱毒株探針中均具有3個簡并堿基，保證了檢測方法的特異性，避免了假陰性的出現(xiàn)。Kim報道TaqMan-vNDV-rRT-PCR在檢測NDV強毒株時存在有一定的漏檢現(xiàn)象，特別是檢測Dove/Italy/2736/2000時出現(xiàn)假陰性[4]。而TaqMan-APMV-1-rRT-PCR在檢測弱毒株Clone 30時也出現(xiàn)了漏檢，僅能夠檢測出部分NDV株，該檢測方法仍需改進或與其它方法聯(lián)合使用。本研究所建立的方法對所檢測樣品的特異性達到100%，檢測樣品中11個NDV株全部為陽性，并有效區(qū)分其中的中強毒株和弱毒株。在臨床樣品試驗中，duplex LNA rRT-PCR共篩查到NDV強毒株2份、弱毒株3份，與Taq-Man-rRT-PCR結果相一致。驗證了本研究所建立方法適合用于實際樣品中NDV的檢測。

根據(jù)理論推算，探針中每一個堿基的錯配可導致降低約一個Ct值，這有可能降低檢測的靈敏度。本研究所建立的duplex LNA rRT-PCR檢測方法與TaqMan-rRT-PCR檢測方法相比，在靈敏度方面大約低10倍，這是本研究方法仍需改進的地方。

Wang、Farkas和EW A ldoust等建立了基于Taq-Man-rRT-PCR檢測方法來鑒別區(qū)分NDV的中強毒株和弱毒株[5-7]?；诜肿臃椒▽DV致病性進行分型的報道還包括地高辛或放射標記的雜交探針法、SYBR Green實時熒光RT-PCR法和熒光水解探針法（包括普通的TaqMan探針法）。但已報道的NDV檢測的分子生物學檢測方法在特異性方面都存在問題，不能檢測出全部NDV株，已有檢測方法仍需改進或與其它檢測方法聯(lián)合使用[7]。而LNA探針技術通過化學修飾來鎖定核酸，可增強雙鏈體的熱穩(wěn)定性，有效提高目標序列雜交的特異性。本研究利用全新的LNA探針法，建立了同時區(qū)分中強毒株和弱毒株的雙重實時熒光RT-PCR檢測方法。該方法能夠特異性檢測NDV并有效區(qū)分中強毒株和弱毒株，適合用于雞場和進出境動物產(chǎn)品中NDV的快速檢測。

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