王 群，鄭小龍，朱來華，肖西志，鄧明俊，岳志芹，孫 濤，趙玉然

（山東出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東青島 266002）

馬媾疫（Dourine）是由錐蟲屬（Trypanosoma）的馬媾疫錐蟲（Trypanosoma equiperdum）寄生于馬屬動(dòng)物的生殖器官所引起一種寄生蟲性傳染病。該病不同于其他錐蟲病，可通過感染馬與健馬交配傳染[1]。

目前，國內(nèi)對(duì)于媾疫錐蟲病的診斷主要是通過病原學(xué)和血清學(xué)檢測(cè)兩種方法。病原學(xué)診斷雖然可以確診，但費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且檢出率低[2]。血清學(xué)診斷中ELISA基本上是全蟲提取抗原，特異性較差；補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)操作繁瑣耗時(shí)，而且影響因素過多，判定比較困難。研究顯示，錐蟲不同亞種蟲株的基因組中存在某些差異[3-4]。本研究利用錐蟲基因組中存在的差異，通過熒光定量PCR技術(shù)建立了一種特異的、快速的媾疫錐蟲檢測(cè)方法。

1 材料和方法

1.1 病毒株和蟲株 馬鼻肺炎病毒（Equid herpesvirus，EHV）、馬動(dòng)脈炎病毒（Equine arteritis virus， EAV）和 馬 流 感 病 毒 （Equine influenza virus，EIV）由本實(shí)驗(yàn)室保存；馬媾疫錐蟲美國株基因組、伊氏錐蟲美國株基因組和馬焦蟲德克薩斯株基因組由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑 DNA提取試劑盒、ExTaqPCR試劑盒、連接試劑盒、DH5a、pMD18-T、DNA Marker DL2000和AMV反轉(zhuǎn)錄酶均購自TaKaRa公司；Power SYBRRGreen PCR Master Mix購自ABI公司；PureLink Micro-to-M idi Total RNA Purification System購自Invitrogen公司。

1.3 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank登錄的馬媾疫錐蟲Maxicircle DNA基因序列（EU185800.1），參照文獻(xiàn)[3]的報(bào)道，選擇其保守區(qū)域，利用Primer primer5.0軟件設(shè)計(jì)一對(duì)基因片段克隆引物，D1-F：5'-TGGGTTTATATCAGGTTCATTTATG-3'和 D1-R：5'-CCCTAATAATCTCATCCGCAGTACG-3'。

選取保守區(qū)域設(shè)計(jì)熒光定量PCR的引物，P1：5'-TGTTTTATAGTATTTTACGCA-3'和 P2：5'-ATCT CATCCGCAGTACGCTGT-3'，擴(kuò)增長(zhǎng)度為 151 bp，由TaKaRa公司合成。

1.4 病毒DNA和RNA的提取及其cDNA的制備各取病毒液100μL，按照DNA提取試劑盒說明書提取病毒DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

取病毒液100μL按照試劑盒的說明書提取病毒RNA，用AMV反轉(zhuǎn)錄酶按照說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.5 馬媾疫錐蟲基因特異性保守片段的擴(kuò)增 以馬媾疫錐蟲基因提取物為模板，采用引物D1-F、D1-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為 94℃ 5 Min；94℃1 Min，56℃ 30 s，72℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃10 Min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.6 SYBR GreenⅠ熒光PCR標(biāo)準(zhǔn)品的制備 將PCR產(chǎn)物切膠回收，連接至pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化DH5α，37℃培養(yǎng)過夜，挑取單個(gè)菌落，擴(kuò)大培養(yǎng)后提取重組質(zhì)粒，挑選經(jīng)PCR鑒定正確的重組質(zhì)粒，由上海英駿（Invitrogen）生物技術(shù)有限公司測(cè)序。將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒命名為pMD-Dourine。

提取重組質(zhì)粒，用Pico drop測(cè)定質(zhì)粒濃度，參照以下公式計(jì)算拷貝數(shù)：copies=ng×10-9×6.02×1023/堿基數(shù)×345。

1.7 SYBR GreenⅠ熒光PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化 以樣本閾值循環(huán)數(shù)（Ct值）、產(chǎn)物熒光值、標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率和相關(guān)系數(shù)等為標(biāo)準(zhǔn)，分別對(duì)PCR反應(yīng)體系中的引物、dNTP、Mg2+濃度和反應(yīng)參數(shù)中退火溫度、讀板溫度進(jìn)行優(yōu)化。

1.8 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 用10倍系列稀釋法處理pMD-Dourine為標(biāo)準(zhǔn)品。取6個(gè)濃度梯度（105、104、103、102、101、100拷貝）質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，以優(yōu)化的反應(yīng)體系和反應(yīng)參數(shù)進(jìn)行 SYBR GreenⅠ熒光PCR反應(yīng)。根據(jù)熒光實(shí)時(shí)PCR的動(dòng)力學(xué)曲線，檢測(cè)儀系統(tǒng)自動(dòng)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線以及回歸方程。

1.9 SYBR GreenⅠ熒光PCR方法特異性、敏感性試驗(yàn) 分別提取馬EHV、EAV、EIV、馬媾疫錐蟲、馬伊氏錐蟲和馬焦蟲的核酸，用所建立的SYBR GreenⅠ熒光定量PCR進(jìn)行檢測(cè)，設(shè)無模板陰性對(duì)照。收集熒光信號(hào)，檢測(cè)其特異性。

用ddH2O對(duì)標(biāo)準(zhǔn)模板進(jìn)行10倍系列稀釋，用所建立的SYBR GreenⅠ熒光定量PCR方法對(duì)各個(gè)稀釋的樣品進(jìn)行檢測(cè)。與此同時(shí)，將10倍系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)模板進(jìn)普通PCR檢測(cè)，電泳觀察結(jié)果。

1.10 SYBR GreenⅠ熒光PCR方法的重復(fù)性試驗(yàn)將10倍系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品在同一時(shí)間、同一地點(diǎn)做3次重復(fù)以及在不同時(shí)間，不同地點(diǎn)做3次重復(fù)，根據(jù)優(yōu)化的SYBR GreenⅠ熒光PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)。并分別計(jì)算組內(nèi)及組間的變異系數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)陽性模板的制備 將擴(kuò)增得到的馬媾疫錐蟲基因特異性保守片段克隆至pMD-18T載體中，利用PCR對(duì)構(gòu)建的重組子進(jìn)行鑒定，得到約400 bp的片段（圖1）。測(cè)序結(jié)果為395 bp，與GenBank中登陸序列（EU185800.1）同源性達(dá)到100%。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 利用試劑盒提取pMD-Dourine重組質(zhì)粒，并測(cè)定其OD值，通過公式計(jì)算得到其濃度為3.8×1010拷貝/μL。稀釋質(zhì)粒至1.0×109拷貝/μL作為原液使用。

將含有1.0×109拷貝/μL的重組質(zhì)粒原液10倍倍比稀釋，分別以 1拷貝 /μL～1.0×105拷貝 /μL稀釋度的重組質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增。用Sequence Detector software進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以起始模板的拷貝數(shù)為橫坐標(biāo)，以Ct值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2）。圖2顯示，Ct值與拷貝數(shù)濃度在1拷貝/μL～1.0×105拷貝/μL之間呈線性關(guān)系，而且R2為0.995。熒光定量PCR的溶解曲線圖顯示，標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解溫度為71℃（圖3）。

圖1 重組質(zhì)粒pMD-Dourine的PCR鑒定結(jié)果Fig.1 Identification of recombinant plasm id

圖2 采用SYBRGreenⅠ實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of Dourine detected by SYBR GreenⅠreal-time PCR

2.3 SYBR GreenⅠ熒光PCR方法特異性、敏感性 使用建立的SYBR GreenⅠ熒光定量PCR方法對(duì)EHV、EAV、EIV、馬焦蟲、伊式錐蟲和馬媾疫錐蟲的陽性DNA樣本進(jìn)行檢測(cè)，只有馬媾疫錐蟲樣本呈現(xiàn)擴(kuò)增曲線（圖4）。將標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒10倍比稀釋，圖5中試驗(yàn)結(jié)果顯示，所建立的檢測(cè)方法在1拷貝/μL時(shí)，仍有熒光信號(hào)。

2.4 熒光定量PCR的重復(fù)性試驗(yàn) 分別以105、104、103、102、101和 100拷貝 /μL 的 pMD-Dourine為模板進(jìn)行組內(nèi)及組間的重復(fù)性試驗(yàn)，記錄Ct值并計(jì)算變異系數(shù)（表1）。通過計(jì)算組內(nèi)的變異系數(shù)為0.305%～3.360%，組間變異系數(shù)為1.491%～3.183%，表明該方法具有良好的重復(fù)性。

圖3 標(biāo)準(zhǔn)品的熔解曲線Fig.3 Themelting curve of standards

圖4 馬媾疫錐蟲實(shí)時(shí)定量PCR特異性檢測(cè)Fig.4 Specificity of the real time PCR method for detecting T.equiperdum

表1 SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光PCR的組內(nèi)、組間重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Intra-assay and Inter-assay reproducibility test of the SYBR Green I real-time PCR

圖5 標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒擴(kuò)增曲線Fig.5 The amplification curve of standard plasm ids

4 討論

隨著經(jīng)濟(jì)全球化的進(jìn)展，國際間馬匹的交流也越來越頻繁，建立快速高效敏感的馬病檢測(cè)方法，對(duì)于保障人們的健康和預(yù)防疫情的爆發(fā)具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)采用SYBR GreenⅠ染料法建立了馬媾疫錐蟲的熒光PCR檢測(cè)體系。

近年來熒光定量PCR技術(shù)憑借其自身檢測(cè)范圍寬、敏感性高、精確度高、無PCR后處理步驟、無交叉污染及高通量，可以進(jìn)行多重檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，廣泛的應(yīng)用于各個(gè)研究領(lǐng)域[5-6]，成為目前應(yīng)用的最熱門的技術(shù)之一。

由于SYBR GreenⅠ與雙鏈DNA的結(jié)合是非特異性的，在PCR過程中產(chǎn)生非特異產(chǎn)物或引物二聚體對(duì)定量結(jié)果均有影響，因此需要優(yōu)化反應(yīng)條件，并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線分析。Li等研究顯示在馬媾疫錐蟲與伊式錐蟲的動(dòng)肌體基因中存在差異[3]，本研究根據(jù)對(duì)GenBank中登錄的錐蟲的動(dòng)肌體基因?qū)Σ町愋蛄羞M(jìn)行了分析，通過軟件設(shè)計(jì)了特異性引物，從根本上避免了PCR擴(kuò)增過程中非特異性擴(kuò)增的發(fā)生。同時(shí)本研究中通過對(duì)MgC12反應(yīng)濃度和引物濃度的優(yōu)化，減少了引物二聚體的產(chǎn)生和影響，并且反復(fù)試驗(yàn)，溶解曲線圖中顯示，試驗(yàn)中并無非特異性擴(kuò)增的影響。

本實(shí)驗(yàn)建立的SYBR GreenⅠ熒光定量PCR方法，對(duì)馬媾疫錐蟲DNA的檢測(cè)下限達(dá)到10拷貝；特異性試驗(yàn)表明，該方法對(duì)馬伊氏錐蟲、馬焦蟲、EHV、EAV、EIV無交叉反應(yīng)，具有良好的特異性。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)建立了靈敏、快速、特異的馬媾疫SYBR GreenⅠ熒光定量PCR檢測(cè)方法，該方法在進(jìn)出境動(dòng)物檢驗(yàn)檢疫、流行病學(xué)調(diào)查及寄生蟲病原鑒定中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

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