苑 麗，吳 華，潘玉善，劉建華，胡功政

（河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，河南鄭州 450002）

目前禽源臨床分離致病菌的多重耐藥現(xiàn)象較為嚴(yán)重[1-4]，為獸醫(yī)臨床有效防控該細(xì)菌病造成了一定困難。細(xì)菌獲得多重耐藥的因素有很多[5]，其中臨床不合理用藥是重要的原因之一。為研究臨床用藥對(duì)細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的影響，本實(shí)驗(yàn)選取臨床分離株LG30雞源大腸桿菌（Escherichia coli）和標(biāo)準(zhǔn)株O78為研究對(duì)象，采用亞抑菌濃度的頭孢曲松或頭孢噻肟單藥為誘導(dǎo)藥物，檢測(cè)不同誘導(dǎo)期的誘導(dǎo)菌對(duì)常用藥物的耐藥性變化，為臨床合理用藥及進(jìn)一步研究禽源分離菌的多重耐藥機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 受試菌株LG30雞源E.coli為本實(shí)驗(yàn)室臨床分離鑒定并保存；標(biāo)準(zhǔn)株O78購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所；氨芐西林（新鄉(xiāng)華星藥廠(chǎng)，含量89.6%，批號(hào)070803）、頭孢曲松（廣州白云山制藥總廠(chǎng)，含量94.8%，批號(hào)070860）、頭孢噻肟鈉（齊魯動(dòng)物保健品有限公司，含量89.1%，批號(hào)070400301）、頭孢噻呋（美國(guó)法瑪西亞普強(qiáng)公司，含量95.8%，批號(hào)070406）、鹽酸頭孢吡肟（悅康藥業(yè)集團(tuán)有限公司，含量89.4%，批號(hào)0705051）、加替沙星（臺(tái)州外高橋聯(lián)通藥業(yè)有限公司，含量99.5%，批號(hào)061022）、恩諾沙星（浙江康裕制藥有限公司，含量98%，批號(hào)070509）、克林沙星、慶大霉素、阿米卡星、氟苯尼考等均為國(guó)產(chǎn)藥，使用時(shí)均在有效期內(nèi)。

1.2 菌種復(fù)活及培養(yǎng) 將各保存菌液50μL分別接種于5 ML LB肉湯中，37℃培養(yǎng)18 h～24 h，接種于LB瓊脂平板，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。次日，分別挑取平板上1～2個(gè)典型菌落接種于LB肉湯，37℃培養(yǎng)18 h～24 h，4℃保存作為種用。

1.3 體外藥敏試驗(yàn) 參照CLSI（2010）[6]推薦的微量稀釋法測(cè)定各受試藥對(duì)細(xì)菌的最小抑菌濃度（M inimal inhibitory concertration，M IC）值，并分析各受試藥物的耐藥率。試驗(yàn)時(shí)，受試菌的菌懸液濃度約為105cfu/mL。試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.4 誘導(dǎo)培養(yǎng) 將新鮮培養(yǎng)的受試菌液0.5 ML接種于4 ML LB肉湯中，再加入0.5 ML適量濃度的頭孢曲松或頭孢噻肟，使肉湯內(nèi)的藥物濃度為相應(yīng)菌株的1/2 MIC，37℃培養(yǎng)18 h~24 h，計(jì)為培養(yǎng)一代。每天繼代一次，共計(jì)培養(yǎng)30代，每隔3代做一次體外藥敏試驗(yàn)，調(diào)整肉湯中的藥物濃度，使之始終保持約1/2 MIC。每隔10代如上法做體外藥敏試驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

不同代次不同藥物誘導(dǎo)菌株對(duì)氨芐西林、慶大霉素和恩諾沙星等11種常見(jiàn)抗菌藥的體外藥敏試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

2008年，M iranda等在研究648株雞源E.coli對(duì)恩諾沙星、多西環(huán)素和磺胺等三類(lèi)藥物使用期、殘留期及未用藥期的耐藥率差異時(shí)表明，在用藥期間雞源E.coli的耐藥率顯著升高，并由此推斷雞群中應(yīng)用抗菌藥將有助于雞源E.coli篩選出耐藥菌株[7]。在本實(shí)驗(yàn)中，由表可知，受試菌誘導(dǎo)前對(duì)受試藥均呈現(xiàn)敏感，各藥的M IC值為<0.13μg/mL～8μg/mL。菌株在含有適量頭孢噻肟或頭孢曲松的LB肉湯中連續(xù)培養(yǎng)至10代時(shí)，O78誘導(dǎo)菌對(duì)頭孢噻肟和頭孢曲松的敏感性均有明顯降低，兩藥的M IC值升高了8倍～64倍，但O78誘導(dǎo)菌仍保持敏感。當(dāng)誘導(dǎo)培養(yǎng)至20代時(shí)，O78誘導(dǎo)菌對(duì)兩藥的敏感性繼續(xù)下降，兩藥的M IC值又升高了2倍～16倍，并且頭孢噻肟誘導(dǎo)的O78菌已對(duì)三代頭孢產(chǎn)生耐藥。此外，4個(gè)20代誘導(dǎo)菌除了對(duì)頭孢吡肟仍保持敏感，對(duì)加替沙星和克林沙星呈敏感或中介外，對(duì)其他種類(lèi)的藥物（包括慶大霉素、阿米卡星、氟苯尼考及恩諾沙星）均已呈現(xiàn)耐藥。當(dāng)繼續(xù)誘導(dǎo)至30代時(shí)，各菌株對(duì)藥物的敏感性進(jìn)一步降低，耐藥程度進(jìn)一步增強(qiáng)，但各藥的M IC值升高速率減慢。表明在頭孢類(lèi)抗菌藥的持續(xù)性選擇性壓力下，細(xì)菌獲得多重耐藥表型的速度是非?？焖俚?，并且不同藥物誘導(dǎo)的菌株對(duì)藥物的敏感性差異僅與誘導(dǎo)代數(shù)密切相關(guān)，與誘導(dǎo)藥物（頭孢噻肟和頭孢曲松）的品種無(wú)明顯關(guān)系。有意思的是，細(xì)菌通過(guò)此種方式獲得的耐藥表型并不僅僅針對(duì)誘導(dǎo)藥物，而是以幾乎相同的速度向多重耐藥發(fā)展，即在頭孢類(lèi)藥物誘導(dǎo)下，細(xì)菌不僅能夠?qū)︻^孢類(lèi)藥物產(chǎn)生耐藥，而且還能夠同時(shí)對(duì)其他種類(lèi)藥物產(chǎn)生耐藥，從而突變?yōu)槎嘀啬退幘闧8-9]。分析原因可能是誘導(dǎo)菌在藥物選擇性壓力下發(fā)生了非特異性的適應(yīng)性改變，如細(xì)菌的細(xì)胞膜通透性下降、細(xì)菌產(chǎn)生了多藥外排泵或細(xì)菌形成了生物被膜等[10-11]。

表1 受試菌對(duì)11種抗菌藥物的敏感性檢測(cè)結(jié)果（μg/mL）Table 1 The susceptibilities of isolates against antim icrobial agents（μg/mL）

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