張 茹，王立生*，王建堯，姚 君，魏 鋮，師瑞月

(1.暨南大學第二臨床醫(yī)學院深圳市人民醫(yī)院，廣東 深圳 518020；2.深圳市兒童醫(yī)院，廣東 深圳 518020)

·實驗研究·

抗小鼠TLR2胞外段單表位抗體TSP-2對小鼠潰瘍性結腸炎外周血和腸系膜淋巴結CD4+CD25+Foxp3+調節(jié)T細胞表達的影響

張 茹1，王立生1*，王建堯2，姚 君1，魏 鋮1，師瑞月1

(1.暨南大學第二臨床醫(yī)學院深圳市人民醫(yī)院，廣東 深圳 518020；2.深圳市兒童醫(yī)院，廣東 深圳 518020)

目的 觀察抗小鼠Toll樣受體2(Toll-like receptor 2)胞外段(mTLR2ECD)單表位抗體TSP-2對潰瘍性結腸炎小鼠外周血和腸系膜淋巴結CD4+CD25+Foxp3+調節(jié)性T細胞表達的影響。方法采用硫酸葡聚糖鈉(C6H7Na3O14S3，DSS)制備潰瘍性結腸炎小鼠模型(UC模型)，將實驗小鼠隨機分成四組：正常對照(NC)組、模型(MD)組、TSP-2治療組和兔IgG治療組。除NC組外，其他實驗組均給予5%DSS造模7 d后停用造模藥，藥物治療組給予后續(xù)干預治療7 d。記錄分析疾病活動指數(DAI)，14 d后處死小鼠，取結腸組織行HE染色；流式細胞儀檢測外周血和腸系膜淋巴細胞中表達CD4+CD25+Foxp3+的Treg細胞的百分比率，并進行統(tǒng)計學分析。結果TSP-2治療組小鼠第9～14天DAI明顯低于MD組(P＜0.05)；MD組外周血和腸系膜淋巴細胞CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞占CD4+T細胞的百分率明顯低于NC組(P＜0.05)；TSP-2治療組外周血和腸系膜淋巴細胞CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞占CD4+T細胞的百分率明顯高于MD組(P＜0.05)；兔IgG治療組與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。結論TSP-2可以提高CD4+CD25+Foxp3+Treg數量，調節(jié)機體和腸道免疫功能，對UC發(fā)揮治療作用。

抗小鼠TLR2；胞外段；單表位抗體TSP-2；潰瘍性結腸炎

潰瘍性結腸炎(Ulcerative colitis，UC)是一種累及機體結腸和直腸的非特異性慢性復發(fā)性炎癥性疾病，病因尚未明確，研究認為本病與遺傳、感染、免疫、環(huán)境以及腸道微生態(tài)失衡等多因素以及相互作用均有重要的關系[1]。調節(jié)性T細胞(Regulatory T cell，Treg)是能抑制其他免疫細胞活化、增殖的一群細胞，在維持自身內環(huán)境的穩(wěn)定、防止自身免疫性疾病的發(fā)生中發(fā)揮重要的保護作用?？剐∈骉LR2胞外段單表位抗體TSP-2具有多種生物學活性：抗炎，抗過敏，調節(jié)免疫等作用[2-3]。本實驗擬研究抗小鼠TLR2胞外段單表位抗體TSP-2對UC的免疫調節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級BALB/c雄性小鼠40只，體重22～26 g，6～8周齡(由南方醫(yī)科大學實驗動物中心提供，合格證號SCXK粵2006-0015)，飼養(yǎng)于清潔級動物房。抗體TSP-2購于英駿生物技術公司，正常兔IgG購于鼎國昌盛生物技術公司(由南方醫(yī)科大學楊翠蘭教授饋贈)。

1.2 試劑 葡聚糖硫酸鈉(DSS，分子量5000)購于廣州齊云生物科技有限公司。核蛋白抽提試劑盒購自Fermantas公司。1640淋巴細胞分離液購于中國醫(yī)學科學院生物工程研究所，膠原酶Ⅲ購于廣州斯佳公司，小鼠調節(jié)T細胞流式染色試劑盒購于eBioscience。

1.3 方法

1.3.1 模型制備與藥物治療 將實驗小鼠隨機分成四組，每組10只：正常對照(NC)組、模型(MD)組、TSP-2治療組(2.5 mg/kg)和兔IgG治療組(2.5 mg/kg)。NC組小鼠飲用蒸餾水14 d，其余三組飲用5%DSS的蒸餾水7 d制備UC模型，然后飲用水換為無5%DSS的蒸餾水再連續(xù)7 d，共14 d。造模7 d后，NC組和MD組腹腔注射生理鹽水，TSP-2治療組和兔IgG治療組分別按上述劑量每日注射TSP-2和兔IgG 1次。14 d后小鼠全部處死，取距肛門1 cm上的結腸組織行檢測。

1.3.2 小鼠結腸炎疾病活動指數評估(DAI) 記錄小鼠每日DIA，參照Murthy評分系統(tǒng)[4]，見表1。

表1 小鼠結腸炎疾病活動指數評估(DAI)

1.3.3 小鼠結腸炎組織病理學評估 取結腸組織，立即投入10%甲醛溶液中，避光固定24 h，行組織脫水、透明及包埋等，切片進行蘇木精-伊紅(HE)染色，鏡下觀察。

1.3.4 流式細胞法檢測 將小鼠摘眼球取血400 μl，經乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，與同體積RPMI-1640充分混合均勻，使用淋巴細胞分離液分離出全血淋巴細胞。分離并取出腸系膜淋巴結，用手術刀小心切成小塊，放入0.1%膠原酶Ⅲ中，37℃，孵育20 min，過200目尼龍網充分研磨，使用淋巴細胞分離液分離出腸系膜淋巴細胞。將上述兩步所得的淋巴細胞，分別溶于1×流式染色緩沖液中，淋巴細胞數調至1×106/管，按照流式試劑盒操作步驟，標記CD4+和CD25+單克隆抗體后，加入固定/破膜反應液在4℃，孵育，避光12 h后，細胞核內抗小鼠Foxp3+抗體染色，使用抗IgG2a作為同型陰性對照管，上機進行流式細胞檢測。

1.4 統(tǒng)計學方法 實驗數據用均數±標準差(x-±s)表示，使用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，各組間的差異采用單因素方差分析，設定P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 小鼠DAI評估 正常組小鼠DAI評分為0；MD組和兔IgG治療組均在第5天到第14天出現(xiàn)明顯的糊狀便或液態(tài)血便、體重減輕，兩組DAI差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；TSP-2治療組從第10天開始未再出現(xiàn)肉眼血便、糞便能成形且體重減輕較少，與MD組和兔IgG治療組比較，TSP-2治療組在第10～14天DAI降低明顯(P＜0.05)，見圖1。

圖1 疾病活動指數

2.2 小鼠結腸病理學評估 與NC組相比較，MD組和兔IgG治療組均表現(xiàn)為腸道的急性炎癥期，伴有黏膜的水腫、糜爛、隱窩明顯減少、大量炎癥細胞浸潤黏膜層和固有層。TSP-2治療組可見腸道黏膜被侵蝕及腺上皮消失等炎癥反應明顯低于MD組。

圖2 小鼠結腸病理(病理切片×200倍)

2.3 抗體TSP-2對UC小鼠外周血與腸系膜淋巴結CD4+CD25+Foxp3+/CD4+百分率的影響 與NC組比較，MD組小鼠外周血與腸系膜淋巴結CD4+CD25+Foxp3+/CD4+百分率顯著降低(P＜0.05)；但是TSP-2治療組小鼠外周血與腸系膜淋巴結CD4+CD25+Foxp3+/ CD4+百分率顯著升高(P＜0.05)；MD組與兔IgG治療組的小鼠外周血與腸系膜淋巴結CD4+CD25+Foxp3+/CD4+百分率相比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

表4 抗體TSP-2對UC小鼠外周血與腸系膜淋巴結CD4+CD25+Foxp3+/CD4+百分率的影響?

表4 抗體TSP-2對UC小鼠外周血與腸系膜淋巴結CD4+CD25+Foxp3+/CD4+百分率的影響?

注：與NC組比較，*P＜0.05；與MD組比較，#P＜0.05。

?

3 討論

UC是一種病因不明的直腸和結腸慢性炎癥疾病，腸系膜淋巴結CD4+CD25+Treg功能異常或數量減少均可發(fā)生與免疫相關的UC[5]。正常狀態(tài)的CD4+CD25+Treg對UC的活動期有明顯的控制作用。Foxp3是核內轉錄因子，證實只有Foxp3表達的腸系膜淋巴結CD4+CD25+Treg才能發(fā)揮對免疫系統(tǒng)的調節(jié)作用；此外Foxp3對腸系膜淋巴結CD4+CD25+Treg表達、成熟及功能發(fā)揮都起到了關鍵的促進作用[6]，而Foxp3的缺乏可誘發(fā)自身免疫疾病[7-8]。Toll樣受體(Toll-like receptors)是機體抵抗感染性疾病的第一道屏障，在UC中的免疫調節(jié)中起關鍵作用，識別侵入體內的微生物進而激活免疫細胞應答[9]。Toll樣受體具有信號轉導功能，在機體抗感染的免疫反應過程中著非常重要作用。TLR2是細菌共有抗原成分的“模式”識別受體，在機體免疫的發(fā)生、發(fā)展中居于核心地位[10]。

本實驗顯示，在DSS誘導的UC小鼠模型中，通過組織病理切片和每日的DAI評分觀察，證實UC小鼠腸道為急性炎癥期，可見腸黏膜有水腫、糜爛、隱窩減少以及炎癥細胞浸潤黏膜層和固有層。同時，流式細胞儀檢測結果顯示外周血與腸系膜淋巴結CD4+CD25+Foxp3+/CD4+百分率明顯降低，腸道免疫狀態(tài)失衡，處于明顯的炎癥反應期，此外，全血中的Foxp3+表達的Treg細胞總數減少，顯示機體的免疫功能處于相對抑制狀態(tài)。因此，腸系膜淋巴結CD4+CD25+Foxp3 Treg與UC的發(fā)生、發(fā)展以及預后都密切相關。本研究通過給予UC小鼠抗小鼠TLR2胞外段單表位抗體TSP-2干預治療后，證實腸黏膜炎癥明顯緩解，糜爛、水腫和炎性細胞浸潤等較MD組明顯減輕；同時，小鼠外周血和腸系膜淋巴結CD4+CD25+Foxp3+/ CD4+百分率明顯升高，但是，正常兔IgG治療組與MD組對照無明顯變化。實驗顯示TSP-2對UC小鼠有良好的治療作用，考慮有以下原因：(1)抗小鼠TLR2胞外段單表位抗體TSP-2可以提高腸道黏膜內的Foxp3+的表達，使有效的Treg細胞功能上得以恢復，使CD4+CD25-Treg向CD4+CD25+Treg轉化增多，平衡了腸道免疫系統(tǒng)從而使腸道的炎癥反應得到相應的控制和腸黏膜的修復。(2)全血中的CD4+CD25+Foxp3+/CD4+百分率明顯升高也進一步證實，腸道局部免疫功能的恢復，對整個機體來說形成了一個良性循環(huán)和反饋作用，使宿主的全身免疫系統(tǒng)得到了相應的調節(jié)，利于病情的恢復和控制。(3)抗小鼠TLR2胞外段單表位抗體TSP-2可能發(fā)揮了其自身的抗感染作用，部分阻斷了病原微生物在腸道中的不良作用，對腸道微生態(tài)菌群起到了明顯的調節(jié)作用，致病菌減少，而益生菌相對增多。(4)TSP-2的抗感染拮抗作用，可能部分緩解腸道內皮細胞腫脹及通透性的增加。

總之，TSP-2能夠提高外周血與腸系膜淋巴結CD4+CD25+Foxp3+/CD4+百分率，從而提高了Foxp3+的表達,可以調節(jié)腸道過度的免疫反應和抗炎作用,對UC發(fā)揮了一定的治療效果。因此，TSP-2作為Toll樣受體的特異性抗體，提高了它在UC治療中的應用價值。

[1]Sartor RB.Therapeutic manipulation of the enteric microflora in inflammatory bowel diseases:antibiotics,probiotics,and prebiotics [J].Gastroenterology,2004,126:1620-1633.

[2]楊翠蘭,趙文忠.抗小鼠TLR2胞外段單表位抗體TSP-2對酵母多糖誘發(fā)小鼠腹膜炎的影響[J].南方醫(yī)科大學學報,2009,29(8): 1521-1524.

[3]楊翠蘭,趙文忠.抗小鼠TLR2胞外段單表位抗體TSP-2對OVA誘導的小鼠過敏性哮喘氣道炎癥的影響[J].熱帶醫(yī)學雜志,2009, 9(8):855-859.

[4]Hirata I,Yasumoto S,Toshina K,et al.Evaluation of the effect of pyrrolidine dithiocarbamate in suppressing inflammation in mice with dextran sodium sulfate-induced colitis[J].World J Gastroenterology,2007,13:1666-1671.

[5]Yu QT,Saruta M,Avanesyan A,et al.Expression and functional characterization of FOXP3+CD4+regulatory T cells in ulcerative colitis[J].Inflamm Bowel Dis,2007,13(2):191-199.

[6]Kamikozuru K,Fukunaga K,Hirota S,et al.The expression profile of functional regulatory T cells,CD4+CD25high+/forkhead box protein P3+,in patients with ulcerative colitis during active and quiescent disease[J].Clin Exp Immunol,2009,156(2):320-327.

[7]Fontenot JD,Rudensky AY.A well adapted regulatory contrivance: regulatory T cell development and the forkhead family transcription factor Foxp3[J].Nat Immunol,2005,6:331-337.

[8]Hori S,Sakaguchi S.Foxp3:a critical regulator of the development and function of regulatory T cells[J].Microbes Infect,2004,6: 745-751.

[9]O'Neill LA,Bryant CE,Doyle SL.Therapeutic targeting of Toll-Like receptors for infectious and inflammatory diseases and cancer[J]. PharmacolRev,2009,61(2):177-197.

[10]Hennessy EJ,ParkerAE,O'Neill LA,et al.Targeting Toll-like receptors:emerging therapeutics?[J].Nat Rev Drug Discov,2010,9(4): 293-307.

R-332

B

1003—6350（2012）20—015—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2012.20.006

2012-03-21)

廣東省自然科學基金項目(編號：10151802001000002)、深圳市重點基金項目(編號：200901003)

張 茹(1981—)，女，廣東省深圳市人，主治醫(yī)師，碩士。

*通訊作者：王立生，博士生導師，研究方向：消化系統(tǒng)疾病診斷與治療。E-mail:wangls168@163.com