莫偉，陳兵*，鄒新輝，尹延慶，梁遠(yuǎn)生，黃梓雄，談山峰，徐軍發(fā)，陳東

(1.廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，廣東湛江524001；2.廣東醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)學(xué)院，廣東湛江524023；3.廣東醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東湛江524005）

不同濃度的PMA和PDTC對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞NF-κB表達(dá)的影響

莫偉1，陳兵1*，鄒新輝1，尹延慶1，梁遠(yuǎn)生1，黃梓雄1，談山峰1，徐軍發(fā)2，陳東3

(1.廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，廣東湛江524001；2.廣東醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)學(xué)院，廣東湛江524023；3.廣東醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東湛江524005）

目的探討不同濃度的PMA和PDTC對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞NF-κB表達(dá)的影響。方法按照不同濃度的PMA及PDTC作用對(duì)純化培養(yǎng)的大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行分組，各組分別作用不同時(shí)間點(diǎn)后，運(yùn)用免疫細(xì)胞化學(xué)方法進(jìn)行NF-κB蛋白表達(dá)測(cè)定，進(jìn)行干預(yù)因素和蛋白表達(dá)結(jié)果的相關(guān)分析。結(jié)果PMA和PDTC對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞NF-κB的活化和抑制作用呈現(xiàn)劑量與時(shí)間依賴(lài)性，24 h達(dá)高峰。結(jié)論可采用PMA及PDTC創(chuàng)建星形膠質(zhì)細(xì)胞NF-κB蛋白不同水平表達(dá)模型。

PMA；PDTC；星形膠質(zhì)細(xì)胞；NF-κB

核轉(zhuǎn)錄因子κB（Nuclear factor-kappa B，NF-κB）是一類(lèi)蛋白質(zhì)，可調(diào)控誘導(dǎo)多種炎癥介質(zhì)及細(xì)胞因子的表達(dá)，參與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖和程序性死亡，在創(chuàng)傷性腦損傷的繼發(fā)性炎癥反應(yīng)發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的樞紐作用[1]。星形膠質(zhì)細(xì)胞(Astrocyte，AST)是腦組織中存在最多的細(xì)胞，在NF-κB方面的研究正越來(lái)越受到重視。本文在體外純化培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞的基礎(chǔ)上，研究NF-κB激活劑佛波醇酯（PMA）及NF-κB抑制劑吡咯醛二硫氨基甲酸（PDTC）在不同劑量與作用時(shí)間下對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞NF-κB的活化和抑制作用，進(jìn)而探討星形膠質(zhì)細(xì)胞在創(chuàng)傷性腦損傷的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)新生SD大鼠200只，鼠齡為24 h內(nèi)，雌雄不限，由廣東醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)提供。

1.2 主要儀器和試劑胎牛血清（四季青），DMEM/F12培養(yǎng)基（美國(guó)GIBCO公司），胰蛋白酶，PMA，PDTC，一抗兔抗大鼠膠質(zhì)原纖維酸性蛋白GFAP，一抗兔抗大鼠NF-κB多克隆抗體，二抗辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG，二抗FITC熒光標(biāo)記山羊抗兔IgG，DAB顯色試劑盒（美國(guó)Sigma公司），多聚甲醛（上?；瘜W(xué)試劑公司），蓋玻片、濕盒（武漢博士德），其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?。Boxun超凈工作臺(tái)（上海博迅），PH140A型培養(yǎng)箱/干燥器（上海一恒）ZD-85恒溫振蕩器，TP7014012熒光顯微鏡(美國(guó)Kodak公司)，LEICADM RX體視學(xué)顯微鏡(德國(guó)Leica公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法新生大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞的純化培養(yǎng)：取出生24 h內(nèi)的SD大鼠，參照McCarthy的方法[2]加以改良，建立大鼠腦星形膠質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng)，冰凍無(wú)菌條件下取大腦皮質(zhì)，仔細(xì)的剝除軟腦膜和血管，剪碎后經(jīng)0.125%胰蛋白酶37℃消化15 min，終止消化并吹打分散；100目濾網(wǎng)過(guò)濾后1 000 r/min× 10離心取沉淀，加完全培養(yǎng)基吹打制成單細(xì)胞懸液(臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)細(xì)胞存活率為90%)。接種于玻璃培養(yǎng)瓶于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，吸取瓶中的細(xì)胞懸液；以l×l05個(gè)/cm2密度散播在預(yù)先涂有多聚左旋賴(lài)氨酸的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，24 h后換液，以后每隔3 d換液一次。繼續(xù)培養(yǎng)12 d，待細(xì)胞鋪滿(mǎn)培養(yǎng)瓶時(shí)，以200 r/min搖床18 h以去除少突膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化處理后，終止消化。孵育30 min，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，吸取瓶中的細(xì)胞懸液，以除去成纖維細(xì)胞，進(jìn)行純化傳代；兩次傳代后即可得純化的星形膠質(zhì)細(xì)胞[3]。采用免疫細(xì)胞化學(xué)GFAP染色進(jìn)行星形膠質(zhì)細(xì)胞的鑒定，純度達(dá)到95%以上的可用于實(shí)驗(yàn)。

細(xì)胞分組和處理：將相同批次細(xì)胞通過(guò)傳代分為5組，將各組神經(jīng)細(xì)胞以3×105/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)滿(mǎn)意后添加藥物用于實(shí)驗(yàn)，空白組予等量PBS液作用。各培養(yǎng)孔采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法進(jìn)行NF-κB蛋白表達(dá)測(cè)定。每批次細(xì)胞均重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

（1）首先進(jìn)行NF-κB激活組的檢測(cè)：分別予PMA 0 μmol/L、0.25 μmol/L、0.5 μmol/L、1 μmol/L、2 μmol/L作用于各組細(xì)胞，分別培養(yǎng)1 h、6 h、12 h、24 h、48 h，觀(guān)察PMA不同濃度的影響及確定NF-κB表達(dá)的高峰時(shí)間。

（2）然后進(jìn)行NF-κB阻斷組的檢測(cè)：各組細(xì)胞分別預(yù)先用NF-κ B抑制劑吡咯醛二硫氨基甲酸（PDTC）0 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、50 μmol/L處理1 h后，再加入激活組實(shí)驗(yàn)中確定的有效濃度PMA，作用到NF-κB表達(dá)的高峰時(shí)間，計(jì)算PDTC有效抑制率。

（3）NF-κB蛋白表達(dá)測(cè)定：每組細(xì)胞到相應(yīng)時(shí)點(diǎn)后收集固定，細(xì)胞爬片以1%甲醇固定(冰上15 rain)，PBS洗3次×5 min，0.1%TritonX-100的PBS室溫作用30 min；吸棄上液后，PBS洗3次×5min，細(xì)胞爬片再以用10%山羊血清室溫封閉30 min；PBS沖洗，加入一抗兔抗大鼠NF-κB多克隆抗體，4℃孵育過(guò)夜；PBS沖洗，加入用PBS稀釋的二抗FITC熒光標(biāo)記山羊抗兔IgG，濕盒內(nèi)避光室溫作用30 min，加入10 μl碘化丙啶染色液復(fù)染，用熒光封片劑封片。

1.4 蛋白表達(dá)的判斷標(biāo)準(zhǔn)高倍鏡下隨機(jī)觀(guān)察每組細(xì)胞5個(gè)以上有代表性視野(不少于1 000個(gè)細(xì)胞)，于Leica激光共聚焦顯微鏡下照相，并用Leica Confocal圖像分析軟件檢測(cè)核區(qū)熒光值，每組計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞(細(xì)胞漿呈綠色熒光)與細(xì)胞總數(shù)（所有細(xì)胞的細(xì)胞核呈紅色熒光）的比值計(jì)數(shù)。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分，沒(méi)有陽(yáng)性細(xì)胞；1分，陽(yáng)性細(xì)胞百分比小于10%；2分，陽(yáng)性細(xì)胞百分比大于10%但小于30%；3分，陽(yáng)性細(xì)胞百分比大于30%但小于60%；4分，陽(yáng)性細(xì)胞百分比大于60%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件；所有參數(shù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示；相同時(shí)間點(diǎn)的各組數(shù)據(jù)之間相互比較采用兩兩比較方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：取α=0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 倒置顯微鏡觀(guān)察星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)以及純度鑒定傳代2～3次后在鏡下見(jiàn)較純化的星形膠質(zhì)細(xì)胞：胞體較大，多呈多形性、扁平狀，胞突較多較長(zhǎng)，細(xì)胞核呈圓形或卵圓形，偏于胞體的一側(cè)。免疫細(xì)胞化學(xué)染色后，鏡下所有細(xì)胞的細(xì)胞核為藍(lán)色，含星形膠質(zhì)細(xì)胞特異抗原GFAP的細(xì)胞漿為棕黃色，標(biāo)記為陽(yáng)性細(xì)胞（圖1）。以隨機(jī)3個(gè)視野中陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)日占細(xì)胞總數(shù)的比例為星形膠質(zhì)細(xì)胞的純度，本實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的純度在95%以上。

圖1 星形膠質(zhì)細(xì)胞免疫細(xì)胞化學(xué)DAB染色(×100倍)

2.2 PMA對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞NF-κB蛋白表達(dá)的激活作用結(jié)果顯示，隨著PMA作用濃度的增加，NF-κB蛋白表達(dá)量逐漸增高，以1μmol/L組與0.5μmol/L組比較的變化最為顯著。PMA在1 μmol/L作用1 h后即可誘導(dǎo)NF-κB的核內(nèi)表達(dá)，與空白組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。各激活組隨著作用時(shí)間增加，NF-κB蛋白表達(dá)量也逐漸增高，24 h達(dá)高峰，與空白組比較差異均有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)表1。

表1 不同濃度PMA作用不同時(shí)間后的NF-κB蛋白表達(dá)評(píng)分（，分）

表1 不同濃度PMA作用不同時(shí)間后的NF-κB蛋白表達(dá)評(píng)分（，分）

注：▲為與空白組比較，P＜0.05；■為與空白組比較，P＜0.01。

空白組0.25 μmol/L組0.5 μmol/L組1 μmol/L組2 μmol/L組0.60±0.07 0.77±0.07■1.26±0.11■3.12±0.15■3.23±0.18■0.60±0.07 0.62±0.05 0.61±0.07 0.68±0.05▲0.69±0.09▲0.60±0.07 0.63±0.06 0.70±0.10▲0.87±0.12■0.81±0.11■0.60±0.07 0.70±0.09▲0.85±0.11■1.53±0.14■1.67±0.13■0.60±0.07 0.78±0.06■1.47±0.08■3.25±0.17■3.32±0.13■

2.3 PDTC對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞NF-κB蛋白表達(dá)的抑制作用依照激活組實(shí)驗(yàn)中確定的PMA有效濃度及作用的高峰時(shí)間，定制PMA1 μmol/L作用24 h做為對(duì)照組，抑制組加入PDTC。結(jié)果顯示，抑制組在10 μmol/L濃度PDTC作用下NF-κB蛋白表達(dá)已開(kāi)始低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），20 μmol/L濃度以上與對(duì)照組比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)表2。

表2 不同濃度PDTC抑制作用后NF-κB蛋白表達(dá)評(píng)分（，分）

表2 不同濃度PDTC抑制作用后NF-κB蛋白表達(dá)評(píng)分（，分）

注：▲為與對(duì)照組比較，P＜0.05；■為與對(duì)照組比較，P＜0.01。

組別對(duì)照組抑制組50 μmol/L 3.25±0.17 1.98±0.12■1 μmol/L 3.25±0.17 3.27±0.23 10 μmol/L 3.25±0.17 2.97±0.17▲20 μmol/L 3.25±0.17 2.12±0.31■

3 討論

星形膠質(zhì)細(xì)胞不僅為神經(jīng)元提供代謝和營(yíng)養(yǎng)支持，而且在保護(hù)神經(jīng)元存活、調(diào)節(jié)突觸功能以及神經(jīng)再生和神經(jīng)修復(fù)中起至關(guān)重要的作用。新近研究發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞參與突觸的形成并調(diào)節(jié)突觸傳遞，參與神經(jīng)的發(fā)生并與神經(jīng)元之間有信息傳遞。它們?cè)谒季S和學(xué)習(xí)過(guò)程中扮演著幾乎和神經(jīng)元一樣重要的角色[4]，NF-κB在神經(jīng)細(xì)胞損傷后的恢復(fù)過(guò)程中扮演著重要的角色[5]。NF-κB蛋白的表達(dá)主要在胞漿中，部分在細(xì)胞核中，它們具有和某些基因上啟動(dòng)子區(qū)的固定核苷酸序列結(jié)合，而啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄的功能。NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的活化與調(diào)節(jié)在干預(yù)細(xì)胞繼發(fā)性死亡方面被認(rèn)為有著重要的意義。在神經(jīng)系統(tǒng)病變?nèi)缒X損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞中與凋亡相關(guān)的多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路均被激活[6]，而轉(zhuǎn)錄因子NF-κB參與的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在其中的作用研究還有待進(jìn)一步深入。因此，創(chuàng)建星形膠質(zhì)細(xì)胞NF-κB蛋白不同水平表達(dá)模型，有助于開(kāi)展星形膠質(zhì)細(xì)胞在NF-κB信號(hào)通路上的機(jī)制研究，進(jìn)而在改善神經(jīng)系統(tǒng)病變導(dǎo)致的細(xì)胞損傷上尋找到新的治療靶點(diǎn)。

佛波醇酯（PMA）是蛋白激酶C（PKC）的激動(dòng)劑。細(xì)胞在靜息狀態(tài)下，NF-κB以無(wú)活性的潛在狀態(tài)存在于細(xì)胞漿中，它與一種抑制因子IκB結(jié)合組成一個(gè)三聚體p50-p65-IκB。三聚體中IκB類(lèi)抑制因子的存在可阻礙p50-p65復(fù)合物的二聚體化和使NF-κB的活性喪失。IκB是PKC的底物，細(xì)胞接受PKC激動(dòng)劑刺激后，PKC活化的同時(shí)，可使IκB磷酸化并與NF-κB分離[7]，從三聚體中解離出來(lái)，暴露出p50亞基上的易位信號(hào)和p65亞基上的DNA結(jié)合位點(diǎn)，從而使此異二聚物表現(xiàn)出NF-κB活性，并從細(xì)胞質(zhì)中易位到細(xì)胞核中，與κB基序(κB motif)相結(jié)合，從而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。本實(shí)驗(yàn)中，在相同作用時(shí)間下，隨著PMA作用濃度的增加，星形膠質(zhì)細(xì)胞中NF-κB蛋白表達(dá)量逐漸增高，1 μmol/L濃度下已能顯著提高NF-κB蛋白表達(dá)。而繼續(xù)增加PMA濃度，NF-κB蛋白表達(dá)升高已不顯著，同時(shí)光鏡下顯示細(xì)胞死亡及損傷情況明顯增加。在PMA相同濃度作用下，NF-κB蛋白表達(dá)量逐漸增高，24 h時(shí)達(dá)到高峰，隨后表達(dá)平穩(wěn)后逐漸下降。

吡咯醛二硫氨基甲酸（PDTC）是一種常見(jiàn)的抗氧化劑，能特異性阻斷NF-κB的傳導(dǎo)通路。其作用機(jī)制來(lái)自?xún)煞矫妫阂皇墙饘衮咸匦?，二是二硫基基團(tuán)清道夫作用。PDTC能抑制NF-κB的活性，從而抑制炎癥因子及粘附分子的表達(dá)，能通過(guò)抑制內(nèi)毒素引起的NF-κB的活化過(guò)程而阻斷炎性細(xì)胞因子IL-6基因的表達(dá)，有可能成為炎癥疾病治療中一類(lèi)很有應(yīng)用前景的藥物[8]。本實(shí)驗(yàn)中，PDTC在10 μmol/L濃度下已可以抑制NF-κB的活化，20 μmol/L濃度下效果較為顯著。繼續(xù)增加PDTC的濃度，有可能使星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷也相應(yīng)增加。

實(shí)驗(yàn)表明，PMA和PDTC對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞NF-κB的活化和抑制作用呈現(xiàn)劑量與時(shí)間依賴(lài)性。藥物作用24 h時(shí)，對(duì)NF-κB的活化和抑制作用可達(dá)到或近乎達(dá)到最高水平。因此，可采用PMA及PDTC創(chuàng)建星形膠質(zhì)細(xì)胞NF-κB蛋白不同水平表達(dá)可控模型，有助于進(jìn)行星形膠質(zhì)細(xì)胞在腦功能改變及修復(fù)方面的研究。

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Effect of different concentration of PMA and PDTC on the expression of NF-ΚB in astrocytes.

MO Wei1,CHEN Bing1,ZHOU Xin-hui1,YIN Yan-qing1,LIANG Yuan-sheng1,HUANG Zi-xiong1,TAN Shan-feng1,XU Jun-fa2, CHEN Dong3.1.Department of Neurosurgery,the Affiliated Hospital of Guangdong Medical College,Zhanjiang 524001, Guangdong,CHINA;2.Department of Clinical Laboratory,Guangdong Medical College,Zhanjiang 524023,Guangdong, CHINA;3.Department of Basic Medicine,Guangdong Medical College,Zhanjiang 524005,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo investigate the effects of different concentration of PMA and PDTC on the expression of NF-ΚB in astrocytes.MethodsRat astrocytes were effected with different concentration of PMA and PDTC for different times.The expression of NF-κB protein was determined by immunocytochemistry.Correlation analysis was performed between the intervention factors and the expression of NF-κB protein.ResultsThe effect of PMA and PDTC on NF-ΚB protein of astrocytes shows dosage dependence and time dependence,which reaches the peak at 24 hour.ConclusionPMA and PDTC could be used to set up astrocytes cell models with different levels of NF-κB protein expression.

PMA;PDTC;Astrocytes;NF-κB;Cell model

R318

A

1003—6350（2012）07—015—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2012.07.006

2011-12-16)

2011年廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院青年科研基金項(xiàng)目(編號(hào)：QK1112)、廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院優(yōu)秀碩士學(xué)位論文培育計(jì)劃（編號(hào)：YS1104）

莫偉（1981—），男，廣東省陽(yáng)江市人，主治醫(yī)師，碩士。

*通訊作者：陳兵，男，博士，副教授，研究方向：微創(chuàng)神經(jīng)外科，創(chuàng)傷性腦損傷的基礎(chǔ)和臨床。E-mail：drcb@163.com