盧珍華

(集美大學(xué)生物工程學(xué)院，福建廈門361021)

枯草芽孢桿菌發(fā)酵魚粉產(chǎn)蛋白酶及其酶解效果

盧珍華

(集美大學(xué)生物工程學(xué)院，福建廈門361021)

為開發(fā)以魚粉為原料的優(yōu)質(zhì)飼料蛋白源以及相關(guān)保健食品，開展了用不同魚粉為氮源發(fā)酵枯草芽孢桿菌生產(chǎn)蛋白酶及其酶解效果的研究，比較了不同菌種的發(fā)酵效果，確定了最佳發(fā)酵時(shí)間.通過蛋白酶活性測(cè)定和氨基態(tài)氮含量測(cè)定分析了不同菌種的產(chǎn)酶能力和酶活性大小及其酶解效果.結(jié)果表明，用羅非魚魚粉和處理過的鱈魚魚粉發(fā)酵商業(yè)化的工業(yè)菌種枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的酶活性顯著高于鰱魚魚粉(P＜0.05)，發(fā)酵后上清液中的氨基態(tài)氮含量也顯著高于鰱魚魚粉(P＜0.05)，即工業(yè)化的枯草芽孢桿菌對(duì)不同魚粉的發(fā)酵效果不同，羅非魚魚粉和處理過的鱈魚魚粉發(fā)酵效果顯著優(yōu)于鰱魚魚粉.

枯草芽孢桿菌;魚粉;蛋白酶;氨基態(tài)氮

0 引言

微生物蛋白酶均為胞外酶，與動(dòng)植物源蛋白酶相比，它具有下游技術(shù)處理相對(duì)簡單、價(jià)格低廉、來源廣、菌體易于培養(yǎng)、產(chǎn)量高、高產(chǎn)菌株選育簡單快速的特點(diǎn)，具有動(dòng)植物蛋白酶所具有的全部特性，同時(shí)易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)［1］.枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)是生產(chǎn)堿性蛋白酶的傳統(tǒng)菌株，具有產(chǎn)蛋白酶量大，耐高溫、高堿等特點(diǎn)，因此，對(duì)枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶的研究成為蛋白酶研究的熱點(diǎn)［2］.魚粉是動(dòng)物飼料中優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)來源，同時(shí)，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，越來越多的以魚粉為基礎(chǔ)的酶解發(fā)酵產(chǎn)物如寡肽等被證明不僅發(fā)揮營養(yǎng)作用［3］，而且具有提高免疫力，改善動(dòng)物胃腸道菌群結(jié)構(gòu)等功能.并且極有可能作為保健食品的功能因子應(yīng)用于保健食品，改善人的免疫力或輔助治療高血壓、糖尿病等［4］.本文通過比較不同來源枯草芽孢桿菌及其不同發(fā)酵條件下不同魚粉的發(fā)酵效果，以探索獲得高效蛋白酶及其酶解產(chǎn)物的途徑.

1 材料與方法

1.1 菌種及培養(yǎng)基

枯草芽孢桿菌由集美大學(xué)生物工程學(xué)院發(fā)酵實(shí)驗(yàn)室提供，有工業(yè)菌種和非工業(yè)菌種2種.

種子培養(yǎng)基 (質(zhì)量分?jǐn)?shù)):牛肉膏1.0%，葡萄糖1.5%，NaCl 0.5%，pH=7.2，121℃蒸氣滅菌20 min;發(fā)酵培養(yǎng)基 (1000 mL):牛肉膏0.1 g，NaCl 5 g，可溶性淀粉1.0 g，葡萄糖0.5 g，氮源分別選擇加工處理過的鱈魚(Gadoux macrocephalus)、干燥的羅非魚(Tilapia mossambica)、新鮮未干燥的鰱魚(Hypophthalmichthys molitrix)魚粉各6 g，水，pH=7.2，121℃蒸氣滅菌20 min.

1.2 主要儀器

7200紫外可見分光光度計(jì) (上海第三分析儀器廠);HH.B11型恒溫培養(yǎng)箱 (上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠);HQ45B型恒溫?fù)u床 (上海科學(xué)院武漢科學(xué)儀器廠);SP－DJ系列垂直凈化工作臺(tái) (上海浦東偉普凈化設(shè)備廠);WH－1漩渦混合器 (上海滬西分析儀器廠);PHS－2C精密酸度計(jì) (上海雷磁儀器廠).

1.3 發(fā)酵培養(yǎng)

從甘油管中取出保存的菌種，以劃線形式接種于含氯霉素的固體培養(yǎng)基平板上，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約24 h.從平板上挑取單菌落接種于種子培養(yǎng)液內(nèi)，37℃培養(yǎng)6 h.然后以10%接種量轉(zhuǎn)接到含有50 mL培養(yǎng)液的250 mL三角瓶中，37℃培養(yǎng).

1.4 酶活力測(cè)定

取發(fā)酵液于4000 r/min離心20 min，取上清液，采用Folin酚法測(cè)定蛋白酶活力［5］.酶活力單位定義為:在55℃、pH=10.0條件下，1 min水解干酪素產(chǎn)生1 μg酪氨酸所需酶量定義為1個(gè)酶活力單位，以U表示.樣品的酶活力 /(U·mL－1)=4AKn/10=2AKn/5.式中:A為樣品平行實(shí)驗(yàn)的平均吸光度值;K為吸光常數(shù)，取134;n為稀釋倍數(shù).

1.5 培養(yǎng)液上清液氨基態(tài)氮含量的測(cè)定

樣品液5 mL，加蒸餾水30 mL，用0.1 mol/L的NaOH溶液中和至pH=7.5，加入中性甲醛溶液10 mL搖勻，用0.1 mol/L的NaOH溶液滴定至pH=9.2，根據(jù)消耗NaOH溶液毫升數(shù)計(jì)算氨基態(tài)氮含量.

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

利用單因素方差分析法分析不同菌種、不同時(shí)間及不同氮源的發(fā)酵效果，差異顯著則進(jìn)行多重比較，應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行分析.

2 結(jié)果

2.1 不同菌種發(fā)酵魚粉產(chǎn)蛋白酶的比較

以鱈魚魚粉為主要氮源，比較工業(yè)菌種和非工業(yè)菌種發(fā)酵后蛋白酶的活力，其結(jié)果如圖1所示.工業(yè)菌種發(fā)酵44、52、60 h取樣的蛋白酶活力顯著高于非工業(yè)菌種(P＜0.05).

2.2 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)蛋白酶活力的影響

以鱈魚魚粉為氮源，工業(yè)菌種發(fā)酵，考察發(fā)酵時(shí)間與發(fā)酵產(chǎn)物蛋白酶活力的關(guān)系，其結(jié)果如圖2所示.由圖2可見，酶活力在發(fā)酵52～56 h達(dá)到最大，顯著高于發(fā)酵48 h或60 h(P＜0.05).

2.3 不同魚粉發(fā)酵效果比較

工業(yè)菌種發(fā)酵55 h，考察對(duì)加工處理過的鱈魚魚粉、干燥的羅非魚魚粉及新鮮未干燥的鰱魚魚粉的發(fā)酵效果，分別測(cè)定酶活力及發(fā)酵上清液中的氨基態(tài)氮.結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌對(duì)羅非魚魚粉和處理過的鱈魚魚粉發(fā)酵中酶活力顯著高于鰱魚魚粉(P＜0.05)(見圖3);枯草芽孢桿菌對(duì)羅非魚魚粉和處理過的鱈魚魚粉發(fā)酵后上清液中的氨基態(tài)氮含量顯著高于鰱魚魚粉(P＜0.05)(見圖4).說明，工業(yè)化的枯草芽孢桿菌在本實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)不同魚粉的發(fā)酵效果不同，對(duì)羅非魚魚粉和處理過的鱈魚魚粉的發(fā)酵效果顯著優(yōu)于鰱魚魚粉.

3 討論

研究表明，工業(yè)化的枯草芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶的能力顯著優(yōu)于天然菌株，而工業(yè)化的枯草芽孢桿菌對(duì)羅非魚魚粉和處理過的鱈魚魚粉的發(fā)酵效果顯著優(yōu)于鰱魚魚粉.魚粉是以蛋白質(zhì)為主要成分的混合物，除氮源外的其他成分如碳源、添加劑等都對(duì)枯草芽孢桿菌的產(chǎn)酶能力有重要影響.發(fā)酵效果的主要表征即寡肽和氨基態(tài)氮的形成取決于微生物蛋白酶的產(chǎn)生效率及不同蛋白質(zhì)基質(zhì)的特性［6－7］，其中，在微生物發(fā)酵過程中，氮源的主要作用是作為微生物細(xì)胞物質(zhì)和含氮代謝物的氮素來源的營養(yǎng)物質(zhì)，氮源作為枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基的一個(gè)主要因素，在芽胞的形成上發(fā)揮著重要作用［8］.不同的蛋白質(zhì)基質(zhì)是影響發(fā)酵效果的主要因素［9］，不同豆類蛋白質(zhì)的發(fā)酵研究表明，大豆和經(jīng)油榨工藝后的豆餅豆粕產(chǎn)寡肽和氨基態(tài)氮的能力顯著高于其他豆類及其副產(chǎn)品［10－11］.本研究表明，羅非魚魚粉和處理過的鱈魚魚粉以及鰱魚魚粉作為不同的氮源，經(jīng)工業(yè)化的枯草芽孢桿菌發(fā)酵后，羅非魚魚粉和處理過的鱈魚魚粉相對(duì)鰱魚魚粉表現(xiàn)較高的酶活力(P＜0.05)，上清液中的氨基態(tài)氮也顯著高于鰱魚魚粉(P＜0.05).本研究還比較了不同菌株的發(fā)酵效果，工業(yè)化的菌株發(fā)酵效果顯著優(yōu)于自然菌株.相關(guān)研究報(bào)道了幾株經(jīng)基因重組技術(shù)改造的工業(yè)化菌株表達(dá)高活性的蛋白酶，顯著提高了蛋白酶的活性和產(chǎn)量，利用該菌種進(jìn)行的發(fā)酵試驗(yàn)表明，寡肽和氨基態(tài)氮均顯著提高［12－13］.

本研究明確了枯草芽孢桿菌對(duì)不同魚粉的發(fā)酵效果，為以魚粉為原料的生物技術(shù)飼料和功能保健食品的開發(fā)奠定了理論基礎(chǔ)，后續(xù)的研究需要明確發(fā)酵產(chǎn)物中寡肽含量及其基本結(jié)構(gòu)，明確發(fā)酵產(chǎn)物的主要營養(yǎng)及保健功能.

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(責(zé)任編輯 馬建華 英文審校 曹敏杰)

Production of Proteases by Fermentation of Bacillus subtilis with Different Fish Meals as Nitrogen Sources

LU Zhen－h(huán)ua
(School of Biological Engineering，Jimei University，Xiamen 361021，China)

To get higher enzymatic activity of proteases produced by Bacillus subtilis by fermentation，different fish meals were used as nitrogen sources.The effects of fermentation time，as well as the difference between commercial and field strains on enzymatic activity were compared.The content of amino nitrogen in the broth of fermentation was also determined.The results suggested that commercial strain showed a better performance in the fermentation with the fish meal of tilapia and codfish compared to silver carp.During the fermentation of Bacillus subtilis using tilapia and codfish meal as nitrogen sources，higher enzymatic activity and content of amino nitrogen were observed.

Bacillus subtilis;fish meal;protease;amino nitrogen

Q 51

A

1007－7405(2012)04－0265－04

2012－03－31

2012－05－14

盧珍華 (1971—)，女，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，從事食品化學(xué)微生物方向研究.