張東澤 于國(guó)輝 汪劍威

(內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院，010059)

Ad-SPK1對(duì)家兔應(yīng)激性潰瘍的治療作用

張東澤 于國(guó)輝 汪劍威

(內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院，010059)

目的 探討腺病毒介導(dǎo)的鞘氨醇激酶對(duì)家兔應(yīng)激性潰瘍愈合的作用及機(jī)制。方法 選取雄性日本大耳白兔30只，按體質(zhì)量隨機(jī)分為三組，分別是模型組、空白對(duì)照組、腺病毒介導(dǎo)的鞘氨醇激酶治療組。模型組和腺病毒介導(dǎo)的鞘氨醇激酶治療組以浸水法建立兔應(yīng)激性潰瘍模型后，分別給予模型組注射生理鹽水，腺病毒介導(dǎo)的鞘氨醇激酶治療組在潰瘍部位注射攜帶SPK1的腺病毒，分別在第15天和第22天胃鏡下觀(guān)察潰瘍區(qū)域，對(duì)愈合質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，硝酸還原法檢測(cè)胃部NO含量。結(jié)果 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，24 h后模型組和腺病毒介導(dǎo)的鞘氨醇激酶治療組內(nèi)鏡和組織學(xué)檢查提示，胃黏膜呈應(yīng)激性潰瘍改變，模型建立成功。模型組與空白對(duì)照組相比，NO水平明顯降低(P＜0.05)；腺病毒介導(dǎo)的鞘氨醇激酶治療組與模型組對(duì)比，電子胃鏡下可見(jiàn)應(yīng)用腺病毒介導(dǎo)的鞘氨醇激酶治療組的潰瘍愈合明顯好于生理鹽水模型組。模型組呈明顯凹陷性潰瘍，潰瘍面被覆壞死組織。腺病毒介導(dǎo)的鞘氨醇激酶治療組15 d時(shí)潰瘍面明顯紅潤(rùn)，肉芽組織增生，少量黏膜上皮覆蓋潰瘍面，潰瘍面皺縮；22 d時(shí)潰瘍面明顯縮小，潰瘍凹陷不明顯，潰瘍面積明顯縮小。同時(shí)，應(yīng)用腺病毒介導(dǎo)的鞘氨醇激酶治療組與模型組相比，NO水平明顯升高(P＜0.05)。結(jié)論 腺病毒介導(dǎo)的鞘氨醇激酶可促進(jìn)實(shí)驗(yàn)兔胃潰瘍黏膜上皮修復(fù)和潰瘍面血管增生，加快潰瘍愈合。其治療機(jī)制可能與NO有關(guān)。

胃潰瘍；鞘氨醇激酶；NO

鞘氨醇激酶(sphingosine kinase，SPK)是調(diào)控細(xì)胞生命活動(dòng)的重要代謝酶，其催化產(chǎn)物是1-磷酸鞘氨醇(sphingosine 1-phosphate，S1P)，是膜脂質(zhì)鞘磷脂的代謝產(chǎn)物，是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的同時(shí)具有細(xì)胞內(nèi)第二信使和細(xì)胞外第一信使雙重功能的脂類(lèi)生物活性分子[1]。構(gòu)建鞘氨醇激酶突變體基因，特異性抑制鞘氨醇激酶的活性，能準(zhǔn)確地了解鞘氨醇激酶本身的生物學(xué)功能。腺病毒是目前使用較多的基因載體，已用于多項(xiàng)臨床基因治療中。利用腺病毒介導(dǎo)的鞘氨醇激酶這種基因療法來(lái)治療消化性潰瘍，目前還比較少見(jiàn)。鞘氨醇激酶是維持細(xì)胞存活的一個(gè)關(guān)鍵分子，S1P是其下游分子，S1P是一種脂類(lèi)促血管生長(zhǎng)因子[2]。據(jù)推測(cè)：SPK-S1P在應(yīng)激性潰瘍愈合中發(fā)揮重要作用。本研究構(gòu)建攜帶鞘氨醇激酶基因的腺病毒載體，轉(zhuǎn)染應(yīng)激性潰瘍動(dòng)物模型的黏膜上皮細(xì)胞，擬在以腺病毒介導(dǎo)的鞘氨醇激酶促進(jìn)應(yīng)激性潰瘍黏膜上皮細(xì)胞增生、遷移以及潰瘍周?chē)苄律难芯炕A(chǔ)上，進(jìn)一步探討SPK1促進(jìn)應(yīng)激性潰瘍愈合的作用及其相關(guān)的分子機(jī)制，研究結(jié)果將為應(yīng)激性潰瘍的治療提供新的思路和靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選取4月齡雄性日本大耳白兔30只，體質(zhì)量(2.0±0.1)kg。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類(lèi)動(dòng)物，清潔級(jí)，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由飲食。隨機(jī)分為三組，分別是模型組，空白對(duì)照組，腺病毒介導(dǎo)的鞘氨醇激酶治療組。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑和儀器 BCA-200 Protein Assay kit(Pierce)；95%乙醇；3%戊巴比妥；Olympus 260型內(nèi)鏡；一氧化氮；pH計(jì)；超純水制備裝置；垂直電泳裝置；低溫冰箱；低溫層析柜；低溫高速離心機(jī)；低溫水浴槽。

1.2 應(yīng)激性潰瘍模型的建立 造模前實(shí)驗(yàn)家兔禁食12 h以上，自由飲水。實(shí)驗(yàn)時(shí)以30 g/L戊巴比妥鈉(30 mg/kg)肌肉注射麻醉后固定于50 cm×25 cm實(shí)驗(yàn)用塑料平板上，然后直立浸于水溫為20～25℃水槽中，水平面與實(shí)驗(yàn)家兔劍突水平齊。浸泡24 h后，擦干皮膚，放入籠中，造模完成。

1.3 實(shí)驗(yàn)給藥及電鏡觀(guān)察 在造模24 h后分別于潰瘍周?chē)つc(diǎn)注射生理鹽水和Ad-SPK1各8 mL(病毒滴度1×109)。于給藥后15 d和22 d后行電子胃鏡檢查。

1.4 胃部NO測(cè)定 NO用硝酸還原酶法原理(比色法)檢測(cè)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 應(yīng)激性胃潰瘍模型成功建立 兩組造模組可見(jiàn)胃內(nèi)有咖啡色內(nèi)容物，沖洗掉之后可見(jiàn)部分胃黏膜充血，胃腺部分的胃黏膜呈彌漫性水腫，并可見(jiàn)多部位、廣泛性的出血和血痂，血痂和胃黏膜結(jié)合比較牢固，分離較難?？瞻讓?duì)照組未見(jiàn)上述改變。

2.2 應(yīng)用腺病毒介導(dǎo)的鞘氨醇激酶 (SPK1基因)對(duì)胃潰瘍治療作用 在胃腺部潰瘍模型中，電子胃鏡下可見(jiàn)圖1:電子胃鏡下，生理鹽水對(duì)照組可見(jiàn)明顯清晰的潰瘍，潰瘍面被覆壞死組織；圖2:空白對(duì)照組黏膜光滑、未見(jiàn)組織缺損；圖3:腺病毒介導(dǎo)的鞘氨醇激酶治療組治療15 d潰瘍面明顯紅潤(rùn)，肉芽組織增生，少量黏膜上皮覆蓋潰瘍面，潰瘍面皺縮；圖4:腺病毒介導(dǎo)的鞘氨醇激酶治療組治療22 d潰瘍面明顯縮小，潰瘍凹陷不明顯。應(yīng)用腺病毒介導(dǎo)的鞘氨醇激酶治療組潰瘍愈合明顯好于生理鹽水對(duì)照組。對(duì)照組呈明顯凹陷性潰瘍，潰瘍面被覆壞死組織；腺病毒介導(dǎo)的鞘氨醇激酶治療組15 d時(shí)和22 d時(shí)潰瘍面明顯縮小，潰瘍凹陷不明顯。

圖1

圖2

2.3 應(yīng)用腺病毒介導(dǎo)的鞘氨醇激酶后胃部NO的變化(表1)從表1可以看出，模型組與空白對(duì)照組相比，胃部NO水平降低，有顯著性差異；應(yīng)用腺病毒介導(dǎo)的鞘氨醇激酶治療后，腺病毒介導(dǎo)的鞘氨醇激酶治療組與模型組相比，胃部NO水平升高，有顯著性差異。

表1 應(yīng)用腺病毒介導(dǎo)的鞘氨醇激酶后胃部NO水平的變化

3 討論

消化性潰瘍?cè)谖覈?guó)的發(fā)病率很高，其發(fā)病機(jī)制和病因也是相當(dāng)復(fù)雜的，主要病因包括幽門(mén)螺旋桿菌感染、胃酸和胃蛋白酶的作用、非甾體抗菌藥物、遺傳因素、胃和十二指腸動(dòng)力異常、應(yīng)激和精神因素等[3]。另外，胃、十二指腸黏膜也應(yīng)該具有良好的血液循環(huán)，這樣的話(huà)上皮細(xì)胞才能不斷更新，黏膜的完整性才能被維持。在機(jī)體受到應(yīng)激的刺激下，胃黏膜可能受到損傷，如果微循環(huán)的功能能保持完整，則可以通過(guò)上皮修復(fù)阻止黏膜損傷的進(jìn)一步發(fā)展；如黏膜損傷較重，破壞了基底膜的完整性，便只能通過(guò)細(xì)胞增生、細(xì)胞外基質(zhì)和深層細(xì)胞的重建來(lái)修復(fù)破損的黏膜[4]。在潰瘍修復(fù)過(guò)程中，與成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮、黏膜上皮細(xì)胞以及漿細(xì)胞甚至平滑肌細(xì)胞等有關(guān)。這些細(xì)胞中，都含有某些特定因子直接影響著潰瘍的修復(fù)質(zhì)量，對(duì)潰瘍修復(fù)過(guò)程起著非常重要的作用[5]。

圖3

圖4

研究表明[6]，鞘氨醇激酶是催化生成S1P的限速酶，發(fā)揮第一信使功能。S1P是一種鞘脂代謝的主要中間產(chǎn)物，是目前公認(rèn)的許多重要的生命過(guò)程中的一個(gè)強(qiáng)有力的調(diào)節(jié)物質(zhì)。Zhang等[7]首次發(fā)現(xiàn)其主要對(duì)細(xì)胞的增生發(fā)揮著積極的影響，同時(shí)其可以引起炎癥、細(xì)胞死亡、血管生成和發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)的作用等。S1P、SphK1或S1P的受體與許多疾病，包括許多類(lèi)型的癌癥、炎癥性疾病，如多發(fā)性硬化癥、哮喘等進(jìn)展密切相關(guān)[8-9]。腺病毒介導(dǎo)的SPK1基因治療可以有效預(yù)防術(shù)后腹腔粘連的形成，其主要原因可能是SPK1通過(guò)促進(jìn)上皮細(xì)胞的增生和遷移發(fā)揮其預(yù)防粘連形成的作用[10]。已往的一些研究結(jié)果表明，SPK1/S1P信號(hào)通路在胃腸上皮細(xì)胞的正常功能發(fā)揮中具有重要作用[11-12]。但系統(tǒng)研究SPK1/S1P信號(hào)在消化性潰瘍修復(fù)中的作用，目前還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

國(guó)內(nèi)資料表明：NO供體可增加胃黏膜NO、氨基乙酸含量、增加胃黏膜血流，有降低胃黏膜完整性的作用。相反，如果NO的合成受到抑制時(shí)，胃黏膜抵制損害因素侵襲的能力明顯下降[13]。在一些實(shí)驗(yàn)中，NO合成抑制劑由于減少胃黏膜血流量而加重消炎痛誘發(fā)的胃黏膜損傷[14]。此外，NO尚有以下作用：減少組胺刺激所引起的胃酸分泌增加；增加胃黏液層厚度；抑制血小板聚集、黏附；抑制中性粒細(xì)胞對(duì)血管內(nèi)皮的黏附和從血管中移出；能與超氧離子發(fā)生反應(yīng)；具有抗氧化劑的作用；NO是胃黏膜的重要保護(hù)因素之一。NO還是一種舒血管物質(zhì)，可直接擴(kuò)張血管，也可作為其他擴(kuò)血管物質(zhì)的協(xié)同因子或終末介質(zhì)，介導(dǎo)胃黏膜充血反應(yīng)，保護(hù)胃黏膜[15]。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組造模成功后，胃部NO水平與空白對(duì)照組相比，NO水平降低明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。應(yīng)用腺病毒介導(dǎo)的鞘氨醇激酶這種治療方法能顯著提高胃組織內(nèi)NO的水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，從而使胃黏膜血液供應(yīng)改善，促進(jìn)損傷組織修復(fù)。因而我們可以認(rèn)為這種治療方法可能是通過(guò)改善胃黏膜微循環(huán)、解除胃黏膜缺血缺氧及能量代謝障礙等多種途徑實(shí)現(xiàn)的。

本研究闡明了SPK1基因治療后對(duì)家兔應(yīng)激性胃潰瘍有一定的修復(fù)作用，可能與升高胃組織NO水平有關(guān)，這可能為應(yīng)激性潰瘍的治療提供了新的治療方向。

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Objective To probe into the function and mechanism of using adenovirus-induced sphingosine kinase1 to treat rabbits'stress ulcer.Methods 30 male Japanese white rabbits were selected and randomly divided into three groups according to their body weight，which were the model group，the blank controller group，and the Ad-SPK1 treatment group.After setting up the rabbits'stress ulcer pattern through flooding method in the model group and the Ad-SPK1 treatment group，the model group were given injection of physiological saline while the Ad-SPK1 treatment group were given injection of SPK1-carried adenovirus at the ulcer position.The ulcer area was observed under gastroscope on the 15th day and the 22nd day respectively，and the quality of healing was assessed，and the No amount in the stomach was detected by nitrate reduction method.Results Animal experiment showed after 24 hours endoscope and histological examination in the model group and the Ad-SPK1 treatment group suggested gastric mucosa got stress ulcer and the pattern successfully set up.Compared with the blank controller group，the model group had a clearly lower NO amount(P＜0.05).Comparison between the Ad-SPK1 treatment group and the model group showed that under electronic gastroscope，the ulcer healing in the Ad-SPK1 treatment group was clearly better than that in the model group.The model group presented obvious hollow ulcer which was covered by necrotic tissues.The Ad-SPK1 treatment group grew red at the ulcer face on the 15th day，granulation tissue accreted，and the ulcer face was covered only by a bit of mucosa epithelium.On the 22nd day the ulcer face clearly shrank without clear hollow area.Compared with the model group，the Ad-SPK1 treatment group had a clearly higher NO amount(P＜0.05).Conclusion Adenovirus-induced sphingosine kinase1(Ad-SPK1)can promote the repair of gastric ulcer mucosa epithelium and the proliferation of blood vessels at the ulcer face.Its treatment mechanism perhaps is related to NO amount.

Gastric ulcer；Sphingosine kinase1；NO

1005-619X(2012)12-1079-03

汪劍威

2012-10-09)