白慧茹 崔春霞 宋芳 顧捷 蘇麗娟 劉薩日娜(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，010059)

IL-8RB mRNA和IL-8RB蛋白在妊娠早期小鼠子宮內(nèi)膜的表達(dá)

白慧茹 崔春霞 宋芳 顧捷 蘇麗娟 劉薩日娜(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，010059)

目的 研究妊娠早期小鼠子宮內(nèi)膜中IL-8RB在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)情況。方法 應(yīng)用半定量RT-PCR、免疫組織化學(xué)顯色和圖像分析技術(shù)，觀察IL-8RB在妊娠1 d、4 d、5 d、6 d小鼠子宮內(nèi)膜中的表達(dá)情況。結(jié)果 免疫組化染色結(jié)果顯示在子宮內(nèi)膜腔上皮，IL-8RB于妊娠4 d表達(dá)最強(qiáng)，妊娠5 d開始逐漸下降，妊娠6 d降至妊娠1 d水平；在子宮內(nèi)膜腺上皮和基質(zhì)，IL-8RB的表達(dá)水平隨妊娠天數(shù)的增加而逐漸升高。RT-PCR結(jié)果顯示IL-8RB mRNA表達(dá)規(guī)律與IL-8RB蛋白在子宮內(nèi)膜腔上皮的表達(dá)相一致。結(jié)論 IL-8RB可能通過與其配體白細(xì)胞介素-8結(jié)合而參與小鼠胚泡著床過程。

IL-8RB；子宮內(nèi)膜；著床；逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)；免疫組織化學(xué)

目前已知白細(xì)胞介素-8(interleukin-8，IL-8)的受體有IL-8RA(IL-8 receptor A)和IL-8RB，均屬于G蛋白偶聯(lián)受體[1]，其中IL-8RB與IL-8的親和力強(qiáng)于IL-8RA。IL-8RB主要表達(dá)于中性粒細(xì)胞表面，正常月經(jīng)周期子宮內(nèi)膜的上皮細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞也有表達(dá)[2]，但是其在妊娠早期子宮內(nèi)膜的表達(dá)情況尚不清楚。本研究運(yùn)用半定量RT-PCR、免疫組織化學(xué)的方法檢測妊娠早期小鼠子宮內(nèi)膜IL-8RB的表達(dá)，為進(jìn)一步闡述它在小鼠胚泡著床過程中的作用機(jī)制提供可能的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)資料。

1 資料與方法

1.1 研究對象 妊娠小鼠：昆明種動(dòng)情期雌鼠與同品系雄鼠2∶1合籠，次日清晨發(fā)現(xiàn)陰栓者為妊娠1 d的小鼠。子宮內(nèi)膜組織標(biāo)本：分別于妊娠1 d、4 d、5 d、6 d用斷頸法處死雌鼠，迅速剪開腹腔，取雙側(cè)子宮，標(biāo)本分為兩份，一份用Bouin液固定，常規(guī)石蠟包埋；另一份凍存于－80℃，以供提取RNA用。

1.2 主要試劑 兔抗人IL-8RB多克隆抗體購于Santa Cruz公司；PV-6001免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。RNArose Reagent購于上海華舜生物工程有限公司；通用RT-PCR試劑盒購于北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司；IL-8RB和內(nèi)參照β-actin的引物均委托大連寶生物工程有限公司合成。

1.3 免疫組織化學(xué)染色 切片常規(guī)脫蠟至水；3%H2O2去離子水室溫閉光孵育15 min，封閉內(nèi)源性過氧化物酶；滴加兔抗人IL-8RB多克隆抗體工作液(1∶150)，37℃恒溫箱中孵育2 h；滴加羊抗兔IgG抗體-HRP多聚體，37℃恒溫箱中孵育30 min。以上各步之間用0.01M PBS緩沖液(pH 7.5)洗3次，每次5 min。最后，DAB室溫閉光顯色4 min，Mayer蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，脫水、透明、封片。陰性對照用抗體稀釋液代替一抗，其他步驟同上。

1.4 RT-PCR法 使用RNArose Reagent抽提總RNA并做定量檢測，依據(jù)下述體系進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，總體積為20 μL，其中dNTPs 1 μL，MMLV(反 轉(zhuǎn) 錄 酶 )1 μL，Oligo(dT)16 μL，Rnasin 0.4 μL，RNA 樣 品 2 μL，ddH2O 10.6 μL，5 ×MMLV酶反應(yīng)緩沖液4 μL。將上述成分混勻后，37℃水浴2 h，95℃熱變性5 min。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物－20℃保存。然后進(jìn)行PCR，PCR反應(yīng)體系總體積為25 μL，其中dNTPs 0.5 μL，ddH2O 7.8 μL，10×PCR反應(yīng)緩沖液2.5 μL，Taq酶0.2 μL，cDNA 4 μL，IL-8RB或β-actin的上游引物5 μL，IL-8RB或β-actin的下游引物5 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃預(yù)變性50 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，72℃再延伸8 min。分別以妊娠1 d、4 d、5 d、6 d小鼠子宮內(nèi)膜cDNA為模板，進(jìn)行PCR。PCR產(chǎn)物分析：取5 μL DNA Marker、10 μL PCR產(chǎn)物點(diǎn)樣，2.0%瓊脂糖凝膠電泳分離，電壓為90 V，電泳時(shí)間30 min，凝膠成像系統(tǒng)紫外光下觀察電泳條帶，拍照。

1.5 圖像分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

1.5.1 免疫組織化學(xué)圖像分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用JeDa 801圖像分析系統(tǒng)測定各天妊娠小鼠子宮內(nèi)膜IL-8RB蛋白表達(dá)的相對含量，取6張不同孕鼠子宮內(nèi)膜切片，每張切片在光學(xué)顯微鏡下(×200)，于腔上皮、腺上皮和基質(zhì)的不同部位各自隨機(jī)測10個(gè)單位面積，IL-8RB蛋白相對含量用(±s)表示。數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，用單因素方差分析(one-way ANOVA)中的LSD法處理，并進(jìn)行兩兩比較，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.5.2 RT-PCR圖像分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用JeDa 801凝膠成像分析系統(tǒng)照像并利用相應(yīng)的系統(tǒng)軟件對DNA條帶進(jìn)行灰度掃描，將同一標(biāo)本IL-8RB DNA條帶的灰度值/β-actin DNA條帶的灰度值作為相對光密度值，表示IL-8RB mRNA的相對含量，分別計(jì)算妊娠1 d、4 d、5 d、6 d小鼠子宮內(nèi)膜組織的平均光密度值(%)，用(±s)表示。數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，用單因素方差分析(one-way ANOVA)中的LSD法處理，并進(jìn)行兩兩比較，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果(圖1～4) IL-8RB蛋白主要定位在子宮內(nèi)膜的腔上皮細(xì)胞、腺上皮細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)以及基質(zhì)中，呈棕黃色顆粒，不同妊娠天數(shù)陽性反應(yīng)強(qiáng)弱不等。藍(lán)紫色為Mayer蘇木精復(fù)染細(xì)胞核。妊娠早期小鼠子宮內(nèi)膜中IL-8RB蛋白表達(dá)的半定量結(jié)果顯示(表1)：在子宮內(nèi)膜腔上皮，妊娠1 d陽性反應(yīng)最弱，妊娠4 d表達(dá)最強(qiáng)，妊娠5 d有所下降，妊娠6 d降至妊娠1 d的水平，不同妊娠天數(shù)兩兩相比，除妊娠1 d與妊娠6 d二者比較無差異外，其余差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；在子宮內(nèi)膜腺上皮和基質(zhì)，隨妊娠天數(shù)增加IL-8RB的表達(dá)逐漸增強(qiáng)，其中妊娠5 d與妊娠6 d的腺上皮相比、妊娠4 d與妊娠5 d的基質(zhì)相比，P＞0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其余兩兩相比，P＜0.01，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 RT-PCR分析(圖5) IL-8RB和β-actin的RT-PCR產(chǎn)物與理論長度一致，分別為509 bp和473 bp。IL-8RB mRNA在妊娠早期小鼠子宮內(nèi)膜組織中的半定量分析結(jié)果為：妊娠1 d表達(dá)最弱(0.108 6±0.021 8)，妊娠4 d表達(dá)最強(qiáng)(0.298 5±0.032 2)，妊娠5 d有所下降 (0.206 6±0.025 8)，妊娠6 d(0.110 3±0.022 4)降至妊娠1 d的水平，不同妊娠天數(shù)兩兩相比，除妊娠1 d與妊娠6 d二者比較無差異外，其余差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

表1 IL-8RB蛋白在妊娠早期小鼠子宮內(nèi)膜表達(dá)水平比較結(jié)果(±s)

表1 IL-8RB蛋白在妊娠早期小鼠子宮內(nèi)膜表達(dá)水平比較結(jié)果(±s)

妊娠天數(shù) 腔上皮 腺上皮 基質(zhì)1 d 0.096±0.011 0.088±0.009 0.065±0.004 4 d 0.143±0.010 0.092±0.007 0.082±0.004 5 d 0.112±0.014 0.099±0.010 0.080±0.005 6 d 0.101±0.012 0.101±0.009 0.088±0.005

圖1 妊娠1 d小鼠子宮內(nèi)膜CXCR2蛋白的表達(dá)

圖2 妊娠4 d小鼠子宮內(nèi)膜CXCR2蛋白的表達(dá)

圖3 妊娠5 d小鼠子宮內(nèi)膜CXCR2蛋白的表達(dá)

圖4 妊娠6 d小鼠子宮內(nèi)膜CXCR2蛋白的表達(dá)

圖5 IL-8RB mRNA在妊娠早期小鼠子宮內(nèi)膜的表達(dá)

3 討論

近年來，人們對IL-8在哺乳動(dòng)物生殖生理過程中的作用研究取得一定進(jìn)展，并且認(rèn)為是IL-8與其相應(yīng)的受體IL-8RBA或IL-8RB結(jié)合，從而趨化和激活中性粒細(xì)胞發(fā)揮作用[3-5]。1998年Iwabe等人[6]通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)在子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞中有IL-8R mRNA的表達(dá)，直到2003年Naciye M等人[2]才首次報(bào)道在正常月經(jīng)周期子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞中均有IL-8RA和IL-8RB蛋白的表達(dá)。

需要特別指出的一點(diǎn)是，目前，關(guān)于IL-8RA和IL-8RB在著床前后子宮內(nèi)膜的表達(dá)情況國內(nèi)外研究的甚少，F(xiàn)rancisco Dominguez等人[7]在體外建立的植入模型中探討胚泡對于子宮內(nèi)膜趨化因子受體表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)在沒有胚泡存在的情況下，僅為數(shù)很少的幾個(gè)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞有幾乎不可測到的IL-8RA的表達(dá)；而在人類胚泡存在的情況下，IL-8RA陽性細(xì)胞不僅數(shù)量增加，而且染色的強(qiáng)度也相應(yīng)增加。而對于IL-8RB的表達(dá)則未見表述。我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：IL-8RB無論是從蛋白水平還是從mRNA水平其在妊娠早期小鼠子宮內(nèi)膜的表達(dá)均呈時(shí)相性，妊娠1 d小鼠子宮內(nèi)膜處于分泌期，IL-8RB有表達(dá)，與Naciye M等人報(bào)道的結(jié)果一致[2]；小鼠胚泡的著床行為發(fā)生在妊娠4 d、5 d，這與IL-8RB在妊娠4 d達(dá)到高峰相符，妊娠5 d、6 d胚泡埋入子宮內(nèi)膜，IL-8RB表達(dá)回落。同時(shí)IL-8RB在腔上皮細(xì)胞中的表達(dá)趨勢與IL-8在妊娠早期小鼠子宮內(nèi)膜腔上皮表達(dá)趨勢相吻合[8]。mRNA的表達(dá)受到多重因素的復(fù)合調(diào)控，其與蛋白的表達(dá)很難同步[9-10]，本研究結(jié)果中IL-8RB mRNA與IL-8RB蛋白的表達(dá)規(guī)律基本趨于一致，在國內(nèi)外文獻(xiàn)中尚未見到報(bào)道。其趨于一致的變化規(guī)律是否穩(wěn)定還需科研工作者的進(jìn)一步研究。從本文的研究結(jié)果，我們推測在胚泡著床過程中，腔上皮通過自分泌機(jī)制上調(diào)IL-8與IL-8RB的表達(dá)，IL-8與腔上皮細(xì)胞的IL-8RB直接結(jié)合，從而介導(dǎo)胚泡與子宮內(nèi)膜的相互作用。隨著胚泡植入子宮內(nèi)膜，IL-8RB在腺上皮細(xì)胞和基質(zhì)中的表達(dá)越來越強(qiáng)，我們認(rèn)為IL-8與腺上皮和基質(zhì)中的IL-8RB直接結(jié)合，促使子宮內(nèi)膜基質(zhì)蛻膜化，為胚泡的植入創(chuàng)造有利的條件。此外，本研究所得到的IL-8RB mRNA在妊娠早期小鼠子宮內(nèi)膜的表達(dá)規(guī)律與IL-8RB蛋白的表達(dá)相一致，這一結(jié)果填補(bǔ)了國內(nèi)外研究IL-8RB mRNA在著床前后子宮內(nèi)膜表達(dá)情況的空白。

綜上所述，IL-8RB在妊娠早期子宮內(nèi)膜的表達(dá)規(guī)律說明IL-8RB可能通過與其配體IL-8直接結(jié)合，參與小鼠胚泡的著床過程。當(dāng)然著床是一個(gè)復(fù)雜的過程，起作用的不只是一個(gè)因子，而是由一些因子共同作用而精密調(diào)節(jié)的[11-12]，IL-8的受體-配體系統(tǒng)在胚泡著床中的具體作用值得深入研究。另外，IL-8RB在胚胎分化和發(fā)育過程中起何種作用也受到國內(nèi)外學(xué)者的重視[13-14]，檢測妊娠6 d以后IL-8RB的表達(dá)情況是深入研究的其中一個(gè)方向和分支。

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Objective To study the expression of IL-8RB in mRNA and protein in mouse endometrium during early pregnancy.Methods The expressions of IL-8RB in mouse endometrium on pregnant Day 1，Day 4，Day 5，and Day 6 were investigated by means of semi-quantitative RT-PCR，immunohistochemistry coloration method and image analysis techniques.Results Immunohistochemistry coloration results showed，in the luminal epithelium of endometrium，the expression of IL-8RB was the strongest on pregnant Day 4，then decreased gradually on Day 5，on Day 6 it reached the level of Day 1.In the glandular epithelium and stroma of endometrium，the expression of IL-8RB increased gradually with the pregnant progress.RT-PCR results showed the expression of IL-8RB mRNA was consistent with the expression of IL-8RB protein in the luminal epithelium of endometrium.Conclusion IL-8RB might take part in the process of mouse blastocyst implantation by combining with its ligand interleukin-8.

IL-8RB；Endometrium；Implantation；Reverse transcriptase polymerase chain reaction(RT-PCR)；Immunohistochemistry

1005-619X(2012)12-1062-03

2012-10-22)