蔣學(xué)兵，馬 聰，陳昌國(guó)，成 海，李文靜，王艷菊

中國(guó)東海與黃海海域海洋細(xì)菌種類與藥物敏感性研究

蔣學(xué)兵，馬 聰，陳昌國(guó)，成 海，李文靜，王艷菊

目的 調(diào)研我國(guó)東海與黃海兩大海域海洋細(xì)菌種類與分布，分析海洋細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的敏感性。方法 用無(wú)菌海水采樣器采集海水進(jìn)行海洋細(xì)菌增菌培養(yǎng)和細(xì)菌分離，挑選單個(gè)菌落，應(yīng)用VITEK全自動(dòng)微生物鑒定儀、API(analytic producls INC)微生物鑒定系統(tǒng)和BIOMIC Vision檢測(cè)儀進(jìn)行細(xì)菌鑒定和藥敏實(shí)驗(yàn)，并對(duì)海水進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。結(jié)果 東海海域:采集54份海水樣本，分離出各種細(xì)菌23種68株，其中弧菌科36株(52.9%)、腸桿菌科21株(30.9%)、非發(fā)酵菌9株(13．2%)、屎腸球菌 1株(1.5%)、真菌 1株(1.5%)。藥敏結(jié)果顯示，在20多種抗菌藥物中，弧菌科、腸桿菌科、非發(fā)酵菌普遍對(duì)亞胺培南、美洛培南、頭孢吡肟、頭孢他啶、左旋氧氟沙星呈高度敏感，敏感性在90%以上，為優(yōu)選抗生素;而對(duì)磺胺甲口惡唑、哌拉西林、頭孢呋辛敏感性較低(＜60%)，為慎用或禁用抗生素;其他抗生素的敏感性為60%～90%，可作為備用抗生素。黃海海域:144份海水樣本分離出各種細(xì)菌24種190株，其中非發(fā)酵菌82株(43.2%)、弧菌科78株(41.1%)、腸桿菌科23株(12.1%)、腸球菌5株(2.6%)，真菌2株(1.0%);藥敏結(jié)果顯示，在20多種抗菌藥物中，弧菌科、腸桿菌科、非發(fā)酵菌普遍對(duì)亞胺培南、美洛培南、頭孢吡肟、頭孢他啶、左旋氧氟沙星呈高度敏感性(＞90%)，為優(yōu)選抗生素;而對(duì)哌拉西林、磺胺甲口惡唑、頭孢呋辛敏感性較低(＜60%)，為慎用或禁用抗生素;其他抗生素的敏感性為60%～90%，可作為備用抗生素。在東海海域中分離出熱帶念株菌，在黃海分離出深紅酵母菌和類星形假絲酵母菌。結(jié)論 本項(xiàng)調(diào)查建立了東海和黃海兩大海域海洋細(xì)菌菌譜及藥物敏感性的本底數(shù)據(jù)庫(kù)，為海上作業(yè)傷、海上意外傷等海洋細(xì)菌感染早期防治研究與抗菌藥物的選用提供了理論依據(jù)。

海洋細(xì)菌;細(xì)菌種類;細(xì)菌鑒定;藥物敏感性試驗(yàn)

目前，各國(guó)都將海洋資源視為戰(zhàn)略資源，隨著海洋資源的開(kāi)發(fā)，海上運(yùn)輸、作業(yè)日趨頻繁，為了解我國(guó)東海與黃海兩海域海洋細(xì)菌種類與分布特點(diǎn)，分析海洋細(xì)菌對(duì)常用抗菌藥物的敏感性，為海上作業(yè)傷和海上意外傷合并海水浸泡時(shí)海洋細(xì)菌早期感染抗生素的選用提供參考，我們于2006－2007年對(duì)東海與黃海海域進(jìn)行了細(xì)菌學(xué)調(diào)查，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 增菌培養(yǎng)基 堿性蛋白胨水、嗜鹽菌增菌液、2號(hào)營(yíng)養(yǎng)肉湯 、緩沖蛋白胨水、液體沙氏增菌液、支原體肉湯增菌液、金黃色葡萄球菌增菌液(均為英國(guó)OXOID產(chǎn)品)，按說(shuō)明書(shū)配制增菌液;厭氧培養(yǎng)瓶(北京伯泰技術(shù)開(kāi)發(fā)中心)。

1.1.2 分離培養(yǎng)基、診斷血清 硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(thiosulfate citrate bile salts sucrose agar culture medium，TCBS)平板、血平板、中國(guó)藍(lán)平板、沙門(mén)志賀菌屬瓊脂(Salmonella Shigella agar，SS)平板、木糖賴氨酸去氧膽酸鹽瓊脂(xylose lysine desoxycholate agar，XLD)平板、沙氏平板、酵母菌顯色平板、蠟樣芽孢平板、支原體瓊脂平板、Mueller-Hinton(MH)瓊脂平板、金葡分離平板與厭氧血平板(中國(guó)藥品生物制品檢定所或天津市金章科技發(fā)展有限公司);霍亂菌與志賀菌診斷血清(蘭州生物制品研究所)。

1.1.3 儀器 VITEK-AMS微生物全自動(dòng)分析儀、API(analytic producls INC)微生物鑒定系統(tǒng)、革蘭陰性鑒定卡(gram-negative identification card，GNI)、革蘭陽(yáng)性鑒定卡(gram positive identification card，GPI)和酵母菌鑒定卡(yeast identification card，YBC)，法國(guó)生物梅里埃公司;BIOMIC Vision檢測(cè)儀(Vastec公司，美國(guó))。

1.2 海水采集方法 用無(wú)菌海水采樣器隨艦船航行時(shí)采集海水，采集點(diǎn)距岸邊東海為50 m～30 km、黃海為50 m～50 km;約每10 km采樣1次;水面下50～100 cm處取海水500 ml，每個(gè)點(diǎn)取2份，每份500 ml。東海海域共采集27個(gè)點(diǎn)54份海水樣本，黃海海域共采集72個(gè)點(diǎn)144份海水樣本。

1.3 細(xì)菌培養(yǎng) 立刻用無(wú)菌注射器取采樣器深部海水10 ml打入?yún)捬踉鼍浚缓蠓謩e在含有10 ml支原體肉湯增菌液、5 ml堿性蛋白胨水、5 ml嗜鹽菌增菌液、5 ml緩沖蛋白胨水、5 ml 2號(hào)營(yíng)養(yǎng)肉湯、5 ml液體沙氏增菌液、5 ml金黃色葡萄球菌增菌液的瓶中加入45 ml海水(均為無(wú)菌操作)，35℃環(huán)境下增菌培養(yǎng)。堿性蛋白胨水與嗜鹽菌增菌液對(duì)海水細(xì)菌增菌培養(yǎng)6～12 h，厭氧菌培養(yǎng)瓶35℃增菌24～48 h，支原體肉湯35℃增菌48～72 h，液體沙氏增菌液35℃增菌24～48 h，其他增菌液增菌培養(yǎng)18～24 h，然后進(jìn)行細(xì)菌分傳培養(yǎng)。

1.4 增菌培養(yǎng)后分傳培養(yǎng) 堿性蛋白胨水與嗜鹽菌增菌液分傳TCBS平板與血平板，35℃孵育18～24 h。2號(hào)營(yíng)養(yǎng)肉湯分傳血平板、中國(guó)藍(lán)平板、蠟樣芽孢平板、沙氏平板與XLD平板，35℃孵育18～24 h。緩沖蛋白胨水分傳XLD、SS平板與中國(guó)藍(lán)平板，35℃孵育18～24 h。厭氧菌肉湯分傳血平板與厭氧血平板，血平板放35℃培養(yǎng)18～24 h，厭氧血平板放厭氧罐35℃培養(yǎng)24～48 h。液體沙氏增菌液分傳沙氏與酵母菌顯色平板，35℃孵育24～72 h，如未見(jiàn)真菌生長(zhǎng)放至168 h。支原體肉湯增菌液分傳支原體瓊脂平板，35℃孵育120～240 h。金葡菌增菌液分傳金葡分離平板，35℃孵育24～48 h。

1.5 鑒定方法 海洋細(xì)菌應(yīng)用VITEK-AMS微生物全自動(dòng)分析儀、GNI、GPI和YBC鑒定卡進(jìn)行細(xì)菌鑒定，應(yīng)用API系統(tǒng)與BIOMIC Vision檢測(cè)儀對(duì)API反應(yīng)板進(jìn)行掃描讀碼確認(rèn)鑒定，應(yīng)用BIOMIC Vision檢測(cè)儀對(duì)MH瓊脂藥敏平板進(jìn)行海洋細(xì)菌的藥物敏感性檢測(cè)。

1.6 海水細(xì)菌菌落計(jì)數(shù) 每個(gè)采集點(diǎn)用10 μl無(wú)菌定量接種環(huán)取海水涂布于血平板2份，置35℃溫箱中培養(yǎng)24～72 h后進(jìn)行細(xì)菌菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算均值。

2 結(jié)果

2.1 海水樣本采集時(shí)海洋環(huán)境因素及海水的理化指標(biāo) 見(jiàn)表1。

表1 海水采集時(shí)海洋環(huán)境因素及海水的理化指標(biāo)

2.2 海洋淺表層細(xì)菌菌落 東海、黃海海水細(xì)菌菌落平均分別為2 752 cfu/ml、1 986 cfu/ml，且兩海域海水細(xì)菌菌落均隨離陸地距離的增加呈梯度下降的現(xiàn)象(表2)。

表2 采樣點(diǎn)離陸地遠(yuǎn)近與海水細(xì)菌菌落

2.3 海洋細(xì)菌檢測(cè) 東海海水樣本中分離出各種海洋細(xì)菌68株，黃海海水樣本中分離出各種細(xì)菌190株(表3)。

表3 東海與黃海海水樣本各類細(xì)菌檢出情況［株(%)］

2.4 東海與黃海海域海洋細(xì)菌種類檢出情況 見(jiàn)表4。

表4 東海與黃海海洋細(xì)菌檢出情況

2.5 東海與黃海海域海洋細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的敏感性 見(jiàn)表5。

表5 東海與黃海海洋細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的敏感性

3 討論

海洋資源作為一種戰(zhàn)略資源越來(lái)越受到各國(guó)的重視，隨著海上作業(yè)活動(dòng)日益增多，海上作業(yè)傷和意外傷合并海水浸泡而致的海洋細(xì)菌感染問(wèn)題越來(lái)越受到醫(yī)學(xué)界的關(guān)注。海洋細(xì)菌學(xué)的研究國(guó)外已有較多報(bào)道［1-3］，我國(guó)微生物工作者對(duì)沿海部分口岸海水細(xì)菌致病性的研究也有陸續(xù)報(bào)道［4-12，17-18］。對(duì)東海和黃海海域海洋細(xì)菌種類與藥物敏感性的大范圍調(diào)研工作，此前鮮見(jiàn)報(bào)道。

調(diào)查結(jié)果顯示:在東海海域分離出的68株細(xì)菌中弧菌占52．9%，其次是腸桿菌科細(xì)菌30.9%和非發(fā)酵菌13.2%;在黃海海域分離出的190株細(xì)菌中，非發(fā)酵菌占43.2%，弧菌占41.1%，腸桿菌占12.1%?；【呛Ｋ械膬?yōu)勢(shì)菌，東海腸桿菌科細(xì)菌的比例明顯高于黃海，黃海非發(fā)酵菌的比例則明顯高于東海，兩海域在細(xì)菌種類構(gòu)成方面存在不同，是否與海水的理化因素及氣候因素相關(guān)，還需要進(jìn)一步的研究。分析發(fā)現(xiàn)近海海水中腸桿菌和非發(fā)酵菌的檢出率高于遠(yuǎn)海，而弧菌的檢出率則相反;東海海水細(xì)菌菌落平均為2 752 cfu/ml，黃海細(xì)菌菌落平均為1 986 cfu/ml，高于賴福才［4］的報(bào)道，并隨離陸地距離的增加海水細(xì)菌菌菌落呈梯度下降的現(xiàn)象。筆者認(rèn)為上述現(xiàn)象與近海離陸地近，受陸地細(xì)菌的影響有關(guān)。

在致病性弧菌中，創(chuàng)傷弧菌引起的疾病最為嚴(yán)重，創(chuàng)傷弧菌感染的傷口如得不到及時(shí)控制，引起的菌血癥和傷口感染的病程進(jìn)展非?？焐踔了劳觯?3-16］。東海與黃海海域均檢出創(chuàng)傷弧菌，應(yīng)引起人們的關(guān)注。值得注意的是在本次調(diào)研中，東海分離出熱帶念珠菌，黃海分離出深紅酵母菌和類星形假絲酵母菌，與賴福才［4］和韓善橋［9］報(bào)道不同。本次調(diào)研未在海水中分離出金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、專性厭氧菌和支原體，也未檢出致病性霍亂弧菌、沙門(mén)菌和志賀菌。

藥敏結(jié)果顯示，在20多種抗菌藥物中，海水里的弧菌科、非發(fā)酵菌和腸桿菌科普遍對(duì)亞胺培南、美洛培南、頭孢吡肟、頭孢他啶、左旋氧氟沙星高度敏感，敏感率在90%以上，這幾種抗菌藥物在海上作業(yè)傷和海上意外傷合并海水浸泡的早期救治中應(yīng)是首選藥物;對(duì)磺胺甲口惡唑、哌拉西林、頭孢呋辛的敏感性較低，為慎用或禁用抗生素;其余抗菌藥物可作為備選藥物。

此次海水細(xì)菌學(xué)調(diào)研摸清了東海與黃海海域海洋細(xì)菌的種類、分布和兩海域細(xì)菌對(duì)目前常用抗菌藥物的敏感性情況，為未來(lái)可能發(fā)生的海上作業(yè)傷、海上意外傷合并海水浸泡條件下的早期感染抗菌藥物的選用提供了理論依據(jù)。

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Studies on the species and antimicrobial susceptibility of marine bacteria in the East Sea and the Yellow Sea of China

JIANG Xue-bing1，MA Cong2，CHEN Chang-guo2，CHENG Hai1，LI Wen-jing1，WANG Yan-ju1
(1.Department of Blood Transfusion，Navy General Hospital，Beijing 100048，China;2.Department of Clinical Laboratory，Navy General Hospital，Beijing 100048，China)

Objective To investigate the species and antimicrobial susceptibility of marine bacteria isolated in the East Sea and the Yellow Sea of China．Methods The seawater samples were taken by sterile sampling instrument，and then enriched，cultured and isolated．Drug sensitivity tested by VITEK-AMS，API system and BIOMIC Vision surveymeter．Results In the East Sea area，a total of 23 kinds，68 marine bacteria were isolated from 54 seawater samples，including 36 vibrios(52.9%)，21 enterobacteria(30.9%)，9 nonfermenters(13.2%)，1 Enterococcus feacium(1.5%)and 1 fungus(1.5%)．Of the more than 20 kinds of antibiotics，the vibrios，enterobacteria and nonfermenters were generally susceptive(＞90%)to Imipenem，Meropenem，Cefepime，Ceftazidime and Levofloxacin，so as those were recommended as first-choice antibiotics．However，the marine bacteria were less sensitivity(＜ 60%)to Piperacillin，Sulfamethoxazole and Cefuroxime，which should be prohibited or used with prudence．The rest of antibiotics，with the sensitivity rate range from 60%to 90%，were recommended as alternate antibiotics．In the Yellow sea area，a total of 24 kinds，190 marine bacteria were isolated from 144 seawater samples，including 82 nonfer-menters(43.2%)，78 vibrios(41.1%)，23 enterobacteria(12.1%)，5 enterococcus(2.6%)and 2 fungi(1.0%)．Of the more than 20 kinds of antibiotics，the vibrios enterobacteria and nonfermenters were generally sensitive(＞90%)to Imipenem，Meropenem，Cefepime，Ceftazidime，Levofloxacin，so as those were recommended as first-choice antibiotics．However，the marine bacteria were less sensitivity(＜60%)to Piperacillin，Sulfamethoxazole and Cefuroxime，which should be prohibited or used with prudence．The rest of antibiotics，with the sensitivity rate range from 60%to 90%，were recommended as alternative antibiotics．The Candida tropicalis was isdated from the East sea，the Rhodotorula rubra andCandida stellatiodea were from the Yellow Sea．Conclusion This investigation provides important data for the establishment of the bacterial spectrum database and sensitivity of the East Sea and the Yellow Sea of China，which supplys a theoretical basis for early-stage infection caused by offshore operation，accidental wound-prevention and the optimizing antibiotic treatment．

Marine bacteria;Species;Identification;Antimicrobial susceptibility test

R378

A

2095-3097(2012)02-0100-04

10.3969/j.issn.2095-3097.2012.02.009

2012-07-02 本文編輯:張?jiān)谖?

全軍醫(yī)藥衛(wèi)生指令性課題(05Z018)

100048北京，海軍總醫(yī)院輸血科(蔣學(xué)兵，成 海，李文靜，王艷菊)，檢驗(yàn)科(馬 聰，陳昌國(guó))

馬 聰，E-mail:macong958166@163.com