常海峰 牛春雨 趙自剛 韓 瑞 張玉平 杜舒婷 杜會(huì)博

(河北北方學(xué)院微循環(huán)研究所，河北 張家口 075029)

研究表明，休克腸淋巴液是加重組織器官損傷的重要因素〔1～3〕，結(jié)扎腸淋巴管，可減少失血性休克以及二次打擊大鼠重要器官肺、腎、心肌、肝組織炎癥因子的產(chǎn)生，降低自由基損傷，改善組織器官功能〔4～8〕，其機(jī)制與減少腸淋巴液攜帶的多種毒性物質(zhì)回流至全身有關(guān)〔9〕;Deitch課題組也報(bào)道失血性休克復(fù)蘇后，腸系膜淋巴液可活化在體和離體的中性粒細(xì)胞，使之通透性增高，促進(jìn)急性肺損傷，如事先行腸系膜淋巴管結(jié)扎，則可防止肺損傷〔10，11〕;雖然腸淋巴管結(jié)扎阻斷了休克淋巴液回流至全身，但在臨床上的應(yīng)用值得考慮。為此，課題組采用淋巴液引流術(shù)，發(fā)現(xiàn)休克淋巴液引流可提高創(chuàng)傷失血性休克(T/HS)大鼠平均動(dòng)脈血壓(MAP)，減輕多個(gè)器官組織損傷的程度，改善器官功能，其機(jī)制與改善能量代謝有關(guān)〔12〕。本文進(jìn)一步從自由基與一氧化氮角度，探討休克淋巴液引流減輕T/HS大鼠多器官損傷的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 18只健康清潔級(jí)Wistar雄性大鼠，體重250～330 g(購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物繁殖中心)，以隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)均分為:對(duì)照組(僅麻醉及手術(shù));淋巴液引流組與淋巴液回流組，后兩組復(fù)制T/HS模型，淋巴液引流組行腸淋巴液引流。

1.2 創(chuàng)傷失血性休克模型復(fù)制 大鼠全身麻醉(肌肉注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%戊巴比妥鈉，劑量50 mg/kg)后，行股部無菌手術(shù)，分離右側(cè)股動(dòng)脈，插三通管連接生物信號(hào)采集系統(tǒng)(成都儀器廠)，記錄 MAP;分離股靜脈，注射質(zhì)量分?jǐn)?shù) 0.5%肝素(1 ml/kg，700 U/ml)全身抗凝。腹部手術(shù)，分離腸淋巴管，行腸淋巴管插管、引流休克腸淋巴液至實(shí)驗(yàn)結(jié)束作為淋巴液引流組;不插管、保證淋巴液回流作為淋巴液回流組。待MAP穩(wěn)定10 min后，淋巴液引流組及回流組大鼠以ZCZ-50型自動(dòng)抽注機(jī)(浙江醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)儀器廠)自股動(dòng)脈勻速放血至40 mmHg，5 min完成，保留備回輸;以調(diào)整放血量維持低血壓90 min后，淋巴液引流組及回流組均以WZF-250F2型雙道微量注射泵(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)儀器有限公司)自股靜脈緩慢回輸放出血液及林格氏液(量為全血量)，時(shí)間控制在20 min左右。對(duì)照組僅麻醉、股部、腹部手術(shù)，不放血及輸液。

1.3 標(biāo)本留取及指標(biāo)檢測(cè) 大鼠于輸液復(fù)蘇后3 h(或相應(yīng)時(shí)間點(diǎn))，選擇固定位置留取腎、肝、肺、心肌組織，應(yīng)用FJ-200型高速分散均質(zhì)機(jī)(上海標(biāo)本模型廠)制備10%組織勻漿，應(yīng)用高速低溫離心機(jī)(德國(guó)科峻)以2 500 r/min離心10 min，取上清液備檢。應(yīng)用改良硫代巴比妥酸微量法、硝酸還原酶法分別檢測(cè)各器官組織勻漿丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)(南京建成)含量，組織勻漿蛋白采用考馬斯亮藍(lán)法定量。

2 結(jié)果

2.1 休克淋巴液引流對(duì)T/HS大鼠器官組織勻漿MDA含量的影響 淋巴液回流組的肺、腎、心肌、肝以及淋巴液引流組心肌組織勻漿的MDA含量均顯著高于假手術(shù)組(P＜0.05;P＜0.01);淋巴液引流組肺、腎、心肌、肝組織勻漿的MDA含量均顯著低于淋巴液回流組(P＜0.01)。見表1。

表1 休克淋巴液引流對(duì)T/HS大鼠器官組織勻漿MDA含量的影響(nmol/mg，，n=6)

表1 休克淋巴液引流對(duì)T/HS大鼠器官組織勻漿MDA含量的影響(nmol/mg，，n=6)

與對(duì)照組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;與淋巴液回流組比較:3)P＜0.01，下表同

1.40±0.21 1.71±0.31 1.78±0.12 1.42±0.15淋巴液回流組2.62±0.602)2.95±0.612)3.60±0.612)3.34±0.822)淋巴液引流組1.38±0.243)1.82±0.503)1.81±0.753)2.09±0.651)3)組別 肺 腎 肝 心肌對(duì)照組

2.2 休克淋巴液引流對(duì)T/HS大鼠器官組織勻漿NO含量的影響 淋巴液回流組的肺、腎、心肌、肝以及淋巴液引流組腎組織勻漿的NO含量均顯著高于假手術(shù)組(P＜0.05;P＜0.01);淋巴液引流組肺、腎、心肌、肝組織勻漿的NO含量均顯著低于淋巴液回流組(P＜0.01)。見表2。

表2 休克淋巴液引流對(duì)T/HS大鼠器官組織勻漿NO含量的影響(nmol/mg，，n=6)

表2 休克淋巴液引流對(duì)T/HS大鼠器官組織勻漿NO含量的影響(nmol/mg，，n=6)

1.60±0.20 2.05±0.19 1.68±0.30 1.98±0.38淋巴液回流組2.51±0.572)3.28±0.442)4.02±0.702)2.66±0.391)淋巴液引流組1.44±0.563)2.46±0.341)3)2.11±0.393)1.57±0.463)組別 肺 腎 肝 心肌對(duì)照組

3 討論

恢復(fù)組織灌流是氧自由基大量產(chǎn)生與釋放的過程，缺血-再灌注引起的氧自由基損傷在休克發(fā)病過程中起重要作用〔13〕。內(nèi)皮細(xì)胞是缺血-再灌注過程中氧自由基的最早來源，氧自由基激活補(bǔ)體，補(bǔ)體系統(tǒng)被激活后，補(bǔ)體活化產(chǎn)物(C3a、C3b、C5a等)可以刺激巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞釋放細(xì)胞因子和氧自由基，后者進(jìn)一步攻擊內(nèi)皮細(xì)胞而加重?fù)p傷。本研究結(jié)果表明，由于失血，T/HS大鼠在休克再灌注后即有大量自由基生成，自由基產(chǎn)物MDA在肺、腎、肝、心肌等組織的含量顯著增多，結(jié)果提示自由基損傷是T/HS大鼠多器官損傷的重要機(jī)制。淋巴液引流組將休克腸淋巴液引流至體外，減少了休克腸淋巴液中毒性物質(zhì)的腸源性移位，抑制了自由基的產(chǎn)生與釋放，降低了各組織器官的MDA含量，從而減輕自由基對(duì)各器官組織細(xì)胞的損傷作用。

NO作為一種具有多重生理功能的介質(zhì)，參與調(diào)節(jié)血管和氣管的平滑肌舒張、抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖、抑制血小板和紅細(xì)胞聚集黏附、神經(jīng)細(xì)胞間的信息傳遞、調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附分子的表達(dá)、機(jī)體免疫防御、細(xì)胞溶解等多方面發(fā)揮重要的作用。近年來的研究表明，NO在休克的病理生理過程中發(fā)揮了重要作用，在內(nèi)毒素、缺氧等刺激因素以及細(xì)胞因子的作用下，由中性粒細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等在iNOS催化作用下合成，與血管反應(yīng)性下降、器官功能衰竭及病死率等密切相關(guān)〔14〕，而NO引起炎癥反應(yīng)的瀑布效應(yīng)，是引起導(dǎo)致多器官損傷的重要原因;降低NO水平可減輕MODS大鼠與失血性休克的器官損傷〔4～7，15〕。本研究結(jié)果顯示，手術(shù)創(chuàng)傷、失血、液體復(fù)蘇后，T/HS大鼠肝、腎、心肌、肺等重要器官的NO含量明顯升高，提示NO參與T/HS的器官功能障礙與損傷;休克淋巴液引流后，上述器官的NO含量下降，說明休克淋巴液引流減少了NO的合成與釋放;同時(shí)，由于NO可通過刺激中性粒細(xì)胞產(chǎn)生呼吸爆發(fā)及脫顆粒，釋放氧自由基和蛋白水解酶，加重組織器官的自由基損傷，形成自由基與炎癥的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，因此休克淋巴液引流降低組織自由基損傷也有可能是通過減少NO實(shí)現(xiàn)的。

從本文研究結(jié)果來看，休克腸淋巴液引流降低自由基損傷與NO水平的作用與腸淋巴管結(jié)扎具有相似的作用;且前期表明，引流休克腸淋巴液引起機(jī)體血容量的小量丟失并未對(duì)機(jī)體產(chǎn)生不良影響，本文為淋巴液引流術(shù)的進(jìn)一步臨床應(yīng)用奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 Deitch EA.Gut lymph and lymphatics:a source of factors leading to organ injury and dysfunction〔J〕.Ann N Y Acad Sci，2010;1207(Suppl 1):E103-11.

2 Fanous MY，Phillips AJ，Windsor JA.Mesenteric lymph:the bridge to future management of critical illness〔J〕.JOP，2007;8(4):374-99.

3 Zhang J，Niu CY，Zhao ZG.The lymphatic microcirculation ＆ shock.In:Zhao KS，Xu Q.Molecular mechanism of severe shock〔M〕.India:Research Signpost，2009:131-55.

4 Niu CY，Li JC，Zhao ZG，et al.Effect of intestinal lymphatic circulation blockage in two-hit rats〔J〕.World J Gastroenterol，2006;12(36):5805-12.

5 Niu CY，Zhao ZG，Ye YL，et al.Mesenteric lymph duct ligation against renal injury in rats after hemorrhagic shock〔J〕.Ren Fail，2010;32(5):584-91.

6 趙自剛，牛春雨，張 靜，等.腸淋巴途徑對(duì)休克大鼠心肌自由基、炎性介質(zhì)的影響〔J〕.中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志，2007;23(4):385-9.

7 趙自剛，牛春雨，張 靜，等.腸淋巴途徑在大鼠休克致肝臟炎癥反應(yīng)中的作用〔J〕.中國(guó)危重病急救醫(yī)學(xué)，2008;20(7):385-9.

8 趙自剛，牛春雨，張 靜，等.腸系膜淋巴管結(jié)扎對(duì)失血性休克大鼠肺損傷的影響〔J〕.中國(guó)危重病急救醫(yī)學(xué)，2007;19(5):274-8.

9 牛春雨，侯亞利，趙自剛，等.腸淋巴途徑在休克大鼠腸源性細(xì)菌/內(nèi)毒素移位發(fā)病學(xué)中的作用〔J〕.中國(guó)危重病急救醫(yī)學(xué)，2007;19(5):266-9.

10 Deitch EA，Adams CA，Lu Q，et al.A time course study of the protective effect of mesenteric lymph duct ligation on hemorrhagic shock-induced pulmonary injury and the toxic effects of lymph from shocked rats on endothelial cell monolayer permeability〔J〕.Surgery，2001;129(1):39-45.

11 Xu DZ，Lu Q，Adams CA，et al.Trauma-hemorrhagic shock-induced upregulation of endothelial cell adhesion molecules is blunted by mesenteric lymph duct ligation〔J〕.Crit Care Med，2004;32(3):760-5.

12 牛春雨，趙自剛，張玉平，等.淋巴液引流對(duì)創(chuàng)傷失血性休克大鼠多器官損傷的影響〔J〕.中華創(chuàng)傷雜志，2010;26(12):1144-8.

13 張春暉，侯亞利，牛春雨，等.腸缺血-再灌注致多器官損傷發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展〔J〕.中國(guó)微循環(huán)，2008;12(6):389-92.

14 Kirkeboen KA，Strand OA.The role of nitric oxide in sepsis an overview〔J〕.Acta Anaesthesiol Scand，1999;43(3):275-88.

15 牛春雨，李繼承，趙自剛，等.腸系膜淋巴管結(jié)扎對(duì)失血性休克大鼠肺組織一氧化氮及其表達(dá)的影響〔J〕.中國(guó)危重病急救醫(yī)學(xué)，2006;18(9):527-30.