田宏哲，徐 靜，胡 睿，趙瑛博，劉文娥

1沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)分析測(cè)試中心，沈陽 110866;2遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局，大連 116001

我國(guó)具有豐富的天然植物資源，其中五味子及其同科類植物在我國(guó)分布范圍很廣，是常用中藥材。五味子科(Schisandraceae)含五味子屬(Schisandra)和南五味子屬(Kadsura)2個(gè)屬約60種，我國(guó)含有兩屬的植物約30種。其中五味子屬約19種，在我國(guó)大部分省區(qū)都有分布，該屬最常用的藥材是五味子(S.chinensis，北五味子)和華中五味子(S.sphenanthera)。五味子屬植物主要含有木脂素、三萜、揮發(fā)油、多糖、有機(jī)酸、氨基酸及微量元素等化學(xué)成分。其中，木脂素為其主要活性成分，有降酶保肝、抑制中樞神經(jīng)、抗衰老等作用。20世紀(jì)70年代，我國(guó)學(xué)者從五味子中分離得到五味子素等7種具有明顯降谷丙轉(zhuǎn)氨酶(SGPT)作用的木脂素后，中國(guó)和日本的學(xué)者［1-4］對(duì)五味子及其同科植物的木脂素成分展開了廣泛的分離鑒定工作，獲得了顯著成果，目前五味子的開發(fā)應(yīng)用也主要是集中在治療肝炎的新藥方面。

木脂素是由二分子苯丙烯衍生物聚合而成的化合物，多數(shù)為游離狀態(tài)，或與糖結(jié)合成甙。五味子中含有豐富的木脂素成分，從植物中提取的木脂素類物質(zhì)活性廣泛，有多種生理活性。如經(jīng)過進(jìn)一步結(jié)構(gòu)修飾和改造，可能獲得更高效的藥物活性成分［5，6］，這是我國(guó)天然藥物開發(fā)的重要方向之一，值得進(jìn)一步研究。

目前測(cè)定五味子中木脂素主要采用液相色譜-紫外法［7-10］、液相色譜-質(zhì)譜法［11］、薄層色譜法［12］等，但五味子木脂素衍生物較多，立體化學(xué)復(fù)雜，采用液相色譜-紫外法很難將復(fù)雜組分完全分開，影響定量準(zhǔn)確性。而薄層色譜法由于分離效率低，不適于復(fù)雜組分分離。

本文建立了LC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定五味子中6種木脂素成分，采用正己烷提取待測(cè)樣品中的目標(biāo)組分，經(jīng)反相高效液相色譜分離，待測(cè)組分先后進(jìn)入DAD檢測(cè)器和離子阱質(zhì)譜中進(jìn)行測(cè)定，該方法排除了樣品基質(zhì)和雜質(zhì)成分的干擾，可對(duì)目標(biāo)組分進(jìn)行準(zhǔn)確的定性定量。通過對(duì)五味子樣品中6種木脂素成分的測(cè)定，對(duì)該方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1100 LC-Trap SL進(jìn)行五味子中木脂素的液相色譜-質(zhì)譜測(cè)定，配有四元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、二極管陣列檢測(cè)器(DAD)等。質(zhì)譜直接進(jìn)樣注射泵(kd Scientific，USA)。KQ-300DE型醫(yī)用數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)。

甲醇(色譜純，F(xiàn)luka)。實(shí)驗(yàn)用“娃哈哈”純凈水(娃哈哈集團(tuán)，杭州)，其它試劑均為分析純。配制的流動(dòng)相均經(jīng)過0.45 μm微孔濾膜過濾。木脂素標(biāo)準(zhǔn)品:五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素(純度 ＞99.0%，購(gòu)自Sigma-Aldrich)。以上標(biāo)準(zhǔn)樣品用色譜純?nèi)軇┡涑?000 mg/L的儲(chǔ)備液，然后稀釋到1.0 mg/L進(jìn)行流動(dòng)注射進(jìn)樣，分別獲取標(biāo)準(zhǔn)樣品的一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜圖，得到準(zhǔn)分子離子峰和碎片離子峰的信息。北五味子果來源于遼寧撫順?biāo)幉姆N植基地。

1.2 樣品制備

將五味子果實(shí)在80℃左右烘4 h，然后粉碎過100目篩。準(zhǔn)確稱取1.0 g五味子粉末，用50 mL正己烷超聲提取30 min后，用正己烷補(bǔ)足損失量，移取20 mL提取液到離心管中，離心10 min(3500 r/min)。取5 mL上清液于雞心瓶中，在40°C水浴蒸至近干，然后用5 mL甲醇重新溶解，過0.45 um濾膜，待分析。

1.3 液相色譜條件

SB-C18色譜柱(150 mm × 2.1 mm i.d.，3.5 μm，Agilent)，流動(dòng)相為甲醇和0.5%甲酸，梯度洗脫，0～35 min甲醇由55%到95%，保持5 min，然后回到初始流動(dòng)相組成，平衡7 min，流速0.2 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量5 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm。

1.4 質(zhì)譜條件

ESI電離源，正離子化模式;干燥氣:8.0 L/min;干燥溫度:325°C;霧化氣壓力:30 psi;毛細(xì)管電壓:4500 v。掃描范圍:100～650 m/z。多反應(yīng)模式監(jiān)測(cè)(MRM)(液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用優(yōu)化參數(shù)見表1)。

表1 采用液質(zhì)聯(lián)用方法分析目標(biāo)五味子木脂素的優(yōu)化參數(shù)Table 1 Optimised parameters for the studied lignans analysed by LC-ESI-MS/MS

2 結(jié)果與討論

2.1 木脂素的液相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)方法建立

首先考察了不同流動(dòng)相對(duì)目標(biāo)組分分離的影響:甲醇-醋酸銨、甲醇-甲酸銨、甲醇-甲酸水溶液等，幾種流動(dòng)相都能把目標(biāo)組分完全分離。但在分離實(shí)際樣品時(shí)，以甲醇-甲酸水溶液的分離效果最好，在液相色譜-紫外檢測(cè)中譜峰尖銳，在質(zhì)譜中離子化效率高(見圖1)，所以選擇甲醇-甲酸水溶液作為本方法的流動(dòng)相。

在190～400 nm內(nèi)對(duì)目標(biāo)組分進(jìn)行了紫外吸收波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)在260 nm左右時(shí)，6種木脂素均有響應(yīng)，且響應(yīng)值較高，因此選擇260 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)，標(biāo)樣譜圖見圖2。

實(shí)驗(yàn)中對(duì)質(zhì)譜分析條件進(jìn)行了優(yōu)化:確定質(zhì)譜離子化模式、干燥氣壓力、溫度、霧化電壓、傳輸及聚焦區(qū)參數(shù)設(shè)置等。由于在液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析有機(jī)化合物時(shí)，當(dāng)采用電噴霧電離源(ESI)時(shí)，一級(jí)質(zhì)譜全掃描模式只能提供目標(biāo)組分的分子離子峰，很難排出雜質(zhì)成分的干擾，會(huì)造成定性以及定量的誤差。本文建立了LC-ESI-MS/MS方法分析木脂素組分，以MRM模式提供的目標(biāo)組分的母離子與子離子組成的離子對(duì)進(jìn)行定性和定量分析(見表1)，從而排除其它組分及未完全分離組分對(duì)目標(biāo)組分的定量干擾。

2.2 提取溶劑的選擇

目前，提取五味子中木脂素主要采用乙醇、甲醇、正己烷、環(huán)己烷及氯仿等有機(jī)溶劑進(jìn)行超聲提取、索氏提取或者微波提取等。在本實(shí)驗(yàn)中嘗試了幾種提取溶劑:甲醇、正己烷、環(huán)己烷、95%乙醇、乙酸乙酯及甲醇-三氯甲烷混合溶劑。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，環(huán)己烷及乙酸乙酯對(duì)6種木脂素提取效率都較低，不能滿足方法要求;其它4種提取溶劑對(duì)幾種木脂素成分皆有較高的提取效率，其中95%乙醇雖然對(duì)五味子醇甲提取率最高，但對(duì)其它目標(biāo)組分提取率較低，(見表2)。綜合考慮，最后選擇正己烷作為6種木脂素的提取溶劑，能夠保證所有目標(biāo)組分都有較高的提取效率。

表2 6種提取溶劑的提取效率(mg/g)Table 2 Effect of different extraction solvents(mg/g)

圖1 采用MRM模式分析6種木脂素標(biāo)樣(0.05 mg/g)的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of 6 lignans(0.05 mg/g)monitored by MRM transitions

2.3 LC-ESI-MS/MS分析木脂素的方法評(píng)價(jià)

在上述實(shí)驗(yàn)條件下測(cè)定6種目標(biāo)組分的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)作圖，線性濃度范圍為0.005～10.0 mg/g:確定了6種目標(biāo)組分的檢測(cè)限(S/N=3)、定量限(S/N=5)、線性方程及線性相關(guān)系數(shù)(見表3)。目標(biāo)組分的定量限為4.0×10-4～1.5 ×10-3mg/g，檢測(cè)限為 2.5 ×10-4～9.0×10-4mg/g，本文所建立的6種木脂素測(cè)定方法完全可以滿足實(shí)際樣品中目標(biāo)組分的檢測(cè)要求。

圖2 采用HPLC-DAD分析6種木脂素標(biāo)樣(0.05 mg/g)的色譜圖Fig.2 Chromatogram of 6 lignans standard solutions(0.05 mg/g)analysed by HPLC-DAD

采用回收率試驗(yàn)進(jìn)行方法評(píng)價(jià)，準(zhǔn)確稱取已知含量樣品作為空白基質(zhì)，分別定量加入6種木脂素標(biāo)準(zhǔn)溶液(添加濃度分別為 0.5，2.0，5.0 mg/g)，然后按照實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行提取和分離檢測(cè)。每個(gè)添加水平進(jìn)行6次重復(fù)試驗(yàn)，測(cè)得添加6種目標(biāo)組分的平均回收率為81.01% ～ 92.45%，RSD 為3.05% ～7.98%，因此，本方法具有很高的準(zhǔn)確度和精密度。

表3 LC-ESI-MS/MS聯(lián)用方法分析6種木脂素的定量限、檢測(cè)限及線性相關(guān)系數(shù)Table 3 Limits of quantification(LOQ)，limits of detection(LOD)and correlation coefficients of 6 lignans analysed by LC-MS/MS

2.4 實(shí)際樣品測(cè)定

將實(shí)驗(yàn)中所建立的五味子木脂素提取方法和分離檢測(cè)方法應(yīng)用于20批五味子果實(shí)中的木脂素測(cè)定，實(shí)際樣品測(cè)定質(zhì)譜總離子流圖見圖3，液相色譜-紫外譜圖見圖4。本方法提供了兩種定性方法:通過液相色譜-紫外方法可獲得樣品中各組分的保留時(shí)間信息、通過質(zhì)譜可得到各組分的監(jiān)測(cè)離子對(duì)及其它子離子信息。通過這兩種方法可對(duì)實(shí)際樣品的組分進(jìn)行定性，確定在所有批次樣品中同時(shí)含有6種待測(cè)目標(biāo)組分:其中五味子醇甲含量為6.67±0.33 mg/g，五味子醇乙2.80 ±0.14 mg/g，五味子酯甲0.83 ±0.05 mg/g，五味子甲素 1.21 ±0.07 mg/g，五味子乙素 3.81 ±0.18 mg/g，五味子丙素 0.90±0.06 mg/g。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了LC-MS/MS法測(cè)定五味子果實(shí)中6種木脂素成分，該方法樣品前處理簡(jiǎn)單、提取效率高、分離效果好、完全排除了其它成分對(duì)目標(biāo)組分的定性和定量分析干擾。采用該方法對(duì)五味子果實(shí)進(jìn)行分析，確定了其中6種木脂素成分的含量，結(jié)果表明在北五味子果實(shí)中五味子醇甲含量最高，五味子酯甲含量最低。本研究為建立五味子藥材的質(zhì)量分析方法提供了參考依據(jù)、為五味子藥材的充分利用提供有力的技術(shù)支持。

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