楊學(xué)娟，陳 鈞，陳 華，劉友彬，張春曉

江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，鎮(zhèn)江 212013

低溫豆粕是大豆經(jīng)低溫提取豆油后的一種副產(chǎn)品。含有豐富的蛋白質(zhì)，是家禽飼養(yǎng)的主要蛋白來源。經(jīng)發(fā)酵以后的豆粕，更易于消化，同時(shí)還含有許多生理活性物質(zhì)，具有重要的功能，如抗氧化，降血壓，降血糖，降血脂，抗癌等等［1-6］。

染料木素(Genistein)為異黃酮的一種，結(jié)構(gòu)見圖1。它具有弱雌激素活性、抗癌、預(yù)防心血管疾病等功能，此外，還具有抗氧化、抗衰老、抗真菌、抑制真菌活性及酪氨酸蛋白激酶活性的功能［7］。染料木素和其他異黃酮成分主要存在于大豆中，在大豆中的含量約為0.1% ～0.5%［8］。對異黃酮的分離純化技術(shù)主要有反相高效液相色譜法經(jīng)典柱色譜法、高速逆流色譜法、固相萃取、膜分離技術(shù)等［9］。其中，傳統(tǒng)柱色譜法比起其他純化技術(shù)，雖然存在不可逆吸附的問題，但其可操作性強(qiáng)，在天然產(chǎn)物的分離純化中廣泛應(yīng)用。

本文利用納豆芽孢桿菌發(fā)酵豆粕，將豆粕中的異黃酮從糖苷形式轉(zhuǎn)化成苷元形式，再使用硅膠柱色譜結(jié)合重結(jié)晶技術(shù)對提取物進(jìn)行分離和提純，得到純度高達(dá)98%的染料木素。

圖1 染料木素結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structure of genistein

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

納豆芽孢桿菌js-1，江蘇大學(xué)藥學(xué)院分離鑒定并保存。

1.1.2 低溫豆粕

安陽漫天雪制造有限公司

1.1.3 儀器

超凈工作臺(蘇州億達(dá)凈化有限公司)，高壓蒸汽滅菌鍋(北京金輝盛業(yè)科技有限公司)，恒溫恒濕搖床(上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(R-200，Switzerland)，紫外可見分光光度計(jì)(UV-2102，上海尤尼柯儀器公司)，高效液相色譜儀(LC-20A-SPD，日本島津)，質(zhì)譜儀(Thermo LXQ，美國)，核磁共振光譜儀(AVANCEⅡ400 MHz，瑞士Bruker)，玻璃色譜柱(柱直徑50 mm，有效長度450 mm)

1.1.4 試劑

乙醇，正丁醇，甲醇，二氯甲烷，乙酸，均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

一方面,若A∈∪i∈IcsOi,則存在i∈I使得A∈csOi,于是A∈csX且A∩Oi≠?,故A∩(∪i∈IOi)≠?,從而A∈cs(∪i∈IOi);另一方面,若A∈cs(∪i∈IOi),則A∈csX且A∩(∪i∈IOi)≠?,于是存在i∈I使得A∩Oi≠?,即存在i∈I使得A∈csOi,于是A∈∪i∈IcsOi,從而cs(∪i∈IOi)=∪i∈IcsOi。

硅膠，青島海洋化工廠。T-AOC試劑盒，南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵豆粕提取物的制備

將豆粕(100 g)以最佳條件進(jìn)行納豆芽孢桿菌發(fā)酵，60℃干燥，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%的酒精提取，濃縮，真空冷凍干燥(凍干粉40 g)。

1.2.2 提取物的預(yù)處理

將提取物凍干粉用適量蒸餾水溶解，以水飽和的正丁醇進(jìn)行萃取，萃余相濃縮，干燥后，再以甲醇提取，甲醇提取物濃縮，干燥即為過柱提取物(7.5 g)

1.2.3 硅膠柱層析

裝柱:實(shí)驗(yàn)采用干法裝柱。將硅膠直接填入柱之中，然后輕輕敲打柱子兩側(cè)，至硅膠界面不再下降為止。

上樣:先用少量的甲醇溶解樣品再和硅膠混勻，然后將混有樣品的硅膠干燥，粉碎成細(xì)粉，均勻地鋪在色譜柱的頂部。

洗脫:用二氯甲烷和甲醇混合液進(jìn)行梯度洗脫(30∶1～0∶1)，收集不同的流分，以薄層層析進(jìn)行跟蹤，合并薄層行為一致的流分，各流分分別濃縮，干燥，測定抗氧化活性強(qiáng)弱，得抗氧化活性最強(qiáng)的流分Ⅱ(0.7 g)，繼續(xù)硅膠柱層析得薄層層析單點(diǎn)的淡黃色粉末(50 mg)。

1.2.4 重結(jié)晶

將此淡黃色粉末以甲醇溶解進(jìn)行重結(jié)晶得淡黃色晶體(37 mg)。

1.2.5 抗氧化能力測定

按照總抗氧化能力(T-AOC)試劑盒進(jìn)行操作。

1.2.6 結(jié)構(gòu)鑒定

取一部分重結(jié)晶的淡黃色晶體，以甲醇溶解，測定UV最大吸收光譜及HPLC;一部分送分析測試中心，檢測1H NMR，13C NMR，以及 MS。

2 結(jié)果與討論

2.1 UV 吸收光譜

從該物質(zhì)的UV掃描光譜(見圖2)可以確定該物質(zhì)的最大吸收波長為260 nm，以此做為HPLC檢測波長。

圖2 染料木素的紫外吸收光譜Fig.2 UV absorption spectra of genistein obtained

2.2 HPLC 分析

以甲醇﹕水(50﹕50)為流動(dòng)相;檢測波長為260 nm的條件進(jìn)行HPLC分析，結(jié)果表明純度達(dá)到98%以上。

圖3 染料木素的高效液相色譜Fig.3 HPLC of genistein obtained

2.3 質(zhì)譜

由質(zhì)譜可以確定活性物質(zhì)的分子量為270。

圖4 染料木素的質(zhì)譜Fig.4 MS of genistein obtained

2.4 NMR

該提取物質(zhì)的C譜、H譜見圖5，圖6，從圖5可以看出該物質(zhì)的核磁共振峰都處在較低場，說明化合物中的碳都以雙鍵或芳環(huán)的形式存在。

13C NMR(MeOD)解析結(jié)果 δ:93.38(C-8)，98.72(C-6)，104.87(C-10)，114.85(C-3’，5’)，121.91(C-3)，123.32(C-1’)，129.97(C-2’，6’)，153.36(C-2)，157.41(C-9)，158.30(C-4)，162.44(C-5)，164.56(C-7)，180.83(C-4)。

1H NMR(MeOD)解析結(jié)果 δ:8.05(s，1H，C2-H)，7.39-7.37(d，2H，C2’，6’-H)，6.87-6.85(d，2 H，C3’，5’-H)，6.34(s，1H，C8-H)，6.23(s，1H，C6-H)，由于使用溶劑是氘代甲醇，所以苯環(huán)上的C5，7，4’-OH 未顯示。

通過綜合分析該物質(zhì)的紫外吸收圖、氫譜、碳譜和質(zhì)譜，以及參考文獻(xiàn)［10-13］可以確定該化合物是染料木素。

3 結(jié)論

本文用常規(guī)的硅膠柱色譜及重結(jié)晶技術(shù)，從發(fā)酵豆粕提取物中分離出染料木素，并經(jīng)UV、MS、1H NMR、13C NMR等多種波譜學(xué)方法鑒定證實(shí)了其結(jié)構(gòu)。高效液相色譜分析表明，所提純的染料木素純度達(dá)到了98%以上。從理論上，為發(fā)酵豆粕開發(fā)成保健食品奠定了基礎(chǔ)。

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