紀(jì)白慧，倪鑫炯，曹玉華

江南大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院，無錫 214122

(石榴(Punica granatum L.)，又名安石榴、干石榴、若榴、丹若、天漿等，為石榴科石榴屬植物，原產(chǎn)于伊朗、阿富汗等中亞地區(qū)。石榴在我國歷史古老淵遠(yuǎn)，自西漢張騫出使西域引入我國至今已有兩千多年。經(jīng)過長年來不斷培育和優(yōu)選，在我國已經(jīng)形成了較有影響力的五大種植地區(qū):陜西臨潼，山東棗莊，安徽懷遠(yuǎn)，四川會理，云南蒙自。據(jù)不完全資料統(tǒng)計(jì)，我國石榴的栽植總面積已經(jīng)達(dá)到100萬畝，超過了伊朗的石榴面積，躍居世界第一位。石榴果樹形態(tài)優(yōu)美，果實(shí)風(fēng)味可口，營養(yǎng)豐富，不僅可以生食，還可以加工制成石榴果汁、果醬、果酒等，是集生態(tài)、經(jīng)濟(jì)、觀賞和保健多重功能的優(yōu)良果樹。

石榴皮含有豐富的多酚類物質(zhì)，包括鞣花單寧、沒食子單寧、鞣花酸、沒食子酸等，占干重量的10%～20%，是石榴皮的重要組成成分。中國藥典規(guī)定干燥石榴皮中所含鞣質(zhì)不得低于10.0%［1］。此外石榴皮中還含有天竺葵素、飛燕草素類花色素以及有機(jī)酸等成分［2］。作為一味古老的民間醫(yī)藥，石榴具有多種藥理作用，石榴皮酸、澀、溫，有澀腸止瀉，止血，驅(qū)蟲之功效，可用于久瀉、久痢、蟲積腹痛等疾病的治療［1］。現(xiàn)代藥理研究表明，石榴皮提取物能夠有效的降低罹患一系列疾病的風(fēng)險，如某些類型的癌癥、炎癥、心血管疾病及神經(jīng)退化等病癥［3-6］。此外，石榴提取物還被研究用于食品防腐和化妝品領(lǐng)域［7-10］。因此，研究和鑒定石榴皮潛在的對人類健康有益的活性物質(zhì)以提高其生物利用度有著重大意義。近年來，抗氧化成為研究者密切關(guān)注的熱點(diǎn)，許多科學(xué)工作者致力于從植物中提取更為安全的天然抗氧化劑來取代人工合成的抗氧化劑［11，12］。國內(nèi)外已有報道指出石榴皮提取物對O-·2、·OH自由基、抑制 LDL 等方面有顯著的抗氧化活性［13，14］，但并未對石榴皮中確切的抗氧化活性成分分析進(jìn)行深入研究。目前，對于石榴皮活性成分的提取主要采用浸提法、回流提取法、超聲波提取法、微波提取法等，其中超聲法和微波法作為新型的提取方法方便、快速、高效而較受青睞［15-17］。本實(shí)驗(yàn)以DPPH抑制率為指標(biāo)超聲提取石榴皮抗氧化成分，經(jīng)溶劑萃取及大孔吸附樹脂純化后利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)鑒定其主要成分，以期得到新型天然抗氧化劑，為石榴的開發(fā)研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料

石榴:產(chǎn)地云南蒙自，江蘇無錫市大潤發(fā)超市售;DPPH(sigma公司);無水乙醇、濃鹽酸、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇(均為國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，分析純;甲酸、甲醇、乙腈(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，色譜純;大孔吸附樹脂(天津海光科技有限公司)。

1.2 儀器

JA2003電子分析天平(上海分析天平儀器廠);TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司);RE-52C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、循環(huán)水式多用真空泵(河南省鞏義市站街光亞儀器廠);Wasters ACQUITY UPLC液-質(zhì)聯(lián)用儀(美國Wasters公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 石榴皮抗氧化成分提取的正交實(shí)驗(yàn)

2.1.1 石榴皮的提取

將石榴皮冷水洗凈，置于40℃恒溫鼓風(fēng)干燥箱中烘干，粉碎機(jī)粉碎。準(zhǔn)確稱取5.0 g石榴皮粉末超聲提取3次，合并濾液并旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑得紅棕色膏狀物，配成生藥濃度為0.1mg/mL的石榴皮粗提液，測定其DPPH抑制率。

2.1.2 抗氧化性的測定

準(zhǔn)確稱取DPPH標(biāo)準(zhǔn)品20 mg，以無水乙醇定容于250 mL容量瓶中，得濃度為0.08 mg/mL的DPPH溶液。精密吸取DPPH溶液3 mL，加入不同提取方法得到的石榴皮提取液1 mL，搖勻后室溫靜置30 min，用紫外分光光度計(jì)在517 nm處測定吸光度值A(chǔ)1，同時測定3 mL無水乙醇與1 mL樣品溶液在517 nm處的吸光度值A(chǔ)2，空白組以1 mL無水乙醇代替試樣，按下式計(jì)算清除率:

A1:加DPPH后樣品溶液吸光度值;A2:不加DPPH，樣品溶液本底吸光度值;A0:不加樣品，空白吸光度值

2.1.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取乙醇濃度、pH、料液比、提取時間四個因素進(jìn)行考察，設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)表L9(34)如表1，以DPPH抑制率作為評價標(biāo)準(zhǔn)，確定石榴皮抗氧化成分最佳提取工藝。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 The factors and levels of orthogonal experiment

2.2 萃取分離

在最佳提取條件下提取石榴皮抗氧化成分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)以除去溶劑得濃縮物。濃縮物用熱水溫浸，冷卻至室溫后，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和水多次萃取。各極性部分除去溶劑后，將得到的5個萃取部分濃縮，以萃取溶劑定容于50 mL容量瓶，取0.1 mL各萃取液用無水乙醇稀釋成50 mL，采用2.1.2下所述方法測定對 DPPH的抑制率。

2.3 大孔吸附樹脂純化

2.3.1 大孔吸附樹脂的選擇

稱取經(jīng)過預(yù)處理的D101、AB-8、NKA-9三種大孔吸附樹脂各2 g于150 mL錐形瓶中，加入已知濃度為0.8 mg/mL石榴皮萃取液50 mL(DPPH的抑制率AC1)，吸附過夜，待充分吸附后，過濾，測定濾液中的DPPH的抑制率AC2。靜態(tài)吸附一定時間后，過濾除去石榴皮粗提物溶液，樹脂用蒸餾水洗凈，置于100 mL錐形瓶中，加入50 mL無水乙醇，于相同條件下解吸，取一定量解吸液，測定其DPPH的抑制率AC3，并按下面的公式計(jì)算吸附率、解吸率及回收率。

式中AC1為起始溶液的DPPH抑制率，AC2為剩余溶液的DPPH抑制率，AC3為解吸液的DPPH抑制率

2.3.2 D101 大孔吸附柱純化

為了分離得到純化物，將濃縮后的正丁醇萃取物加入預(yù)處理過的D101大孔吸附樹脂中，待活性成分與樹脂充分交換后，先用1 BV的蒸餾水沖洗去除提取物中的糖類、蛋白質(zhì)等大分子，控制流速為2 BV/h。水洗脫后再用3 BV的60%乙醇溶液進(jìn)行解吸，收集解吸液。解吸液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮得石榴皮純化物。

2.4 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)分析

取一定量石榴皮純化物的甲醇溶液進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析。色譜條件:BEH C18色譜柱 (2.1 mm ×100 mm × 1.7 μm);WATERS ACQUITY PDA檢測器;檢測波長380 nm;流動相為乙腈(A相)-0.1%乙酸水溶液(B相)，梯度洗脫程序:0～0.1 min，100%B 相，0.1～5 min，0～30%A 相，100%～70%B 相，5～7 min，30% ～100%A 相，70% ～0%B 相;柱溫:45 ℃;流速:0.3 mL/min，進(jìn)樣量:1 uL。質(zhì)譜條件:離子條件ESI-，毛細(xì)管電壓3.5 kv;錐孔電壓20 v;離子源溫度100℃;脫溶劑溫度300℃;質(zhì)量范圍50～1000，檢測器電壓:1700 v。

3 結(jié)果與分析

3.1 正交實(shí)驗(yàn)分析

通過正交實(shí)驗(yàn)對影響提取的四個因素進(jìn)行極差分析，以DPPH抑制率為應(yīng)力進(jìn)行評價，結(jié)果見下表，各因素對石榴皮抗氧化成分提取的影響程度為料液比＞提取時間＞乙醇濃度＞pH，最佳提取組合為A2B1C2D2，即最佳提取工藝為:乙醇濃度60%、pH3、料液比(m/v)1∶15、提取3 次，每次40 min。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 The result of orthogonal design test

3.2 石榴皮各萃取物抗氧化性

利用不同極性溶劑萃取，分別得到石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇及水五種萃取物。其中，石油醚和氯仿萃取物均為淡黃色粉末，乙酸乙酯萃取物為淡黃色晶狀物，正丁醇萃取物為棕黃色粉末，水萃取物為深棕色膏狀物。各部分萃取物抗氧化效果如下圖所示。

圖1 石榴皮各萃取物DPPH抑制率Fig.1 DPPH scavenging of different extractives

從圖1可以看出，各部分萃取物對DPPH抑制作用強(qiáng)弱順序?yàn)?正丁醇萃取物＞水萃取物＞乙酸乙酯萃取物＞氯仿萃取物＞石油醚萃取物。石油醚和氯仿萃取物因?yàn)槠渲饕煞譃橹苄院腿鯓O性物質(zhì)，故抗氧化效果較弱，DPPH抑制率僅為4.13%、5.62%。乙酸乙酯萃取物的 DPPH抑制率為21.95%，顯示出一定的抗氧化效果，但抑制作用不夠明顯。水萃取物的顏色最深，且抑制率達(dá)到41.15%，可能一些色素類成分溶于其中而具有較強(qiáng)的抗氧化作用。正丁醇萃取物的抑制率最高，達(dá)62.68%，表明該萃取部分含有豐富的抗氧化活性物質(zhì)，故對該部分萃取物進(jìn)行深入研究。

3.3 大孔吸附樹脂的選擇

表3 三種樹脂物理性能及吸附性比較Table 3 physical properties and adsorbabilities of three resins

評價一種樹脂的優(yōu)劣主要考察其吸附性能以及解吸性能這兩個重要參數(shù)。三種大孔吸附樹脂吸附性能篩選結(jié)果見表3。由表3可以看出，三種樹脂對石榴皮抗氧化成分均有吸附作用。其中，D101樹脂無論是吸附率，還是解吸率都要優(yōu)于其他兩種樹脂，且回收率也達(dá)到76.18%。雖然D101為非極性樹脂，但是能夠特異性吸附水溶性多酚類物質(zhì)，這可能與其適合的表面結(jié)構(gòu)、較高的比表面積及較小的孔徑有關(guān)。綜合考慮，選擇D101樹脂純化石榴皮中的抗氧化成分。

3.4 石榴皮萃取物液相色譜圖分析

經(jīng)純化處理過的石榴皮萃取液經(jīng)液相色譜法分析后得到液相色譜圖，由圖可以看出石榴皮萃取物主要含有兩個色譜峰，分別在保留時間t1=1.39 min和t2=1.68 min。為了確定這兩個組分，采用質(zhì)譜法進(jìn)行了分析。

圖2 石榴皮純化物液相色譜圖Fig.2 UPLC chromatograms of pomegranate peel purificated fraction

3.5 石榴皮純化物質(zhì)譜圖分析

通過質(zhì)譜對石榴皮抗氧化組分進(jìn)行定性分析得到的結(jié)果如下圖(圖3、圖4)，根據(jù)質(zhì)譜所得的碎片峰、準(zhǔn)分子離子峰、特征離子的質(zhì)譜分布及液相色譜的保留時間，參考相關(guān)文獻(xiàn)［18-21］，確定了這兩個組分分別是 α-安石榴苷(t=1.39 min)和 β-安石榴苷(t=1.68 min)兩種異構(gòu)體，屬于石榴皮中結(jié)構(gòu)較復(fù)雜的鞣花單寧類物質(zhì)。

圖3、圖4顯示這兩種物質(zhì)對應(yīng)的分子離子峰［M－H+］均為m/z1083。主要形成四種碎片離子m/z=781、m/z=601、m/z=301 及 m/z=275。推斷其裂解途徑(圖5)為安石榴甙(punicalagin，m/z=1083)失去一分子六羥基聯(lián)苯二甲?；?HHDP)，形成安石榴林(punicalin，m/z=781)，安石榴林失去一分子的葡萄糖得到?jīng)]食子酸四聚體(gallagic acid，m/z=601)，再裂解形成鞣花酸(ellagic acid，m/z=301)，鞣花酸開環(huán)脫去一分子甲酰基(-CO)最后形成 3，4，8，9，10-五羥基-［b，d］-苯并吡喃-6-酮(m/z=275)。一般來說，鞣質(zhì)中的酚羥基是其具有生理活性的基礎(chǔ)，可水解鞣質(zhì)的酚羥基數(shù)目越多其生理活性越強(qiáng)，同時，連接位置、立體構(gòu)型及結(jié)構(gòu)中其他基團(tuán)都是與活性強(qiáng)弱有關(guān)的重要因素［22］。從結(jié)構(gòu)上看，安石榴苷含有HHDP及多個酚羥基結(jié)構(gòu)，由多個的酚核串聯(lián)而成，這些活性基團(tuán)決定了安石榴苷對DPPH顯示出很強(qiáng)的抑制作用。

圖5 石榴苷異構(gòu)體UPLC-MS裂解途徑Fig.5 UPLC-MS fragmentation of punicalagin isomers

4 結(jié)論

通過正交實(shí)驗(yàn)分別考察了提取溶劑的濃度、pH、料液比、提取時間四個因素對石榴皮抗氧化成分提取的影響，得到最優(yōu)化提取條件為:乙醇濃度60%、pH=3、料液比(m/v)1∶15、提取 3 次，每次 40 min。石榴皮的石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和水萃取物對DPPH均有一定的抑制作用，其中正丁醇萃取物的抗氧化作用最強(qiáng)，說明石榴皮中抗氧化物質(zhì)主要為極性較強(qiáng)的一類物質(zhì)。經(jīng)過D101大孔吸附樹脂吸附，水洗去除無活性物質(zhì)并用60%乙醇洗脫，分離得到石榴皮抗氧化成分純化物。利用液質(zhì)連用技術(shù)對石榴皮純化物進(jìn)行分析，得到石榴皮抗氧化成分主要是安石榴苷的兩種異構(gòu)體(α-安石榴苷和β-安石榴苷)。本實(shí)驗(yàn)研究所建立的提取和純化石榴皮抗氧化成分的方法簡單、實(shí)用，分離得到的安石榴苷可作為潛在的食品和化妝品添加劑，為其在更廣泛領(lǐng)域的開發(fā)應(yīng)用提供參考。

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