秦 艷，馮衛(wèi)華，*，白衛(wèi)東，2，譚杏婷，沈 棚

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院，廣東廣州 510225；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州510642）

響應(yīng)面分析法優(yōu)化臍橙皮中多酚類(lèi)物質(zhì)提取工藝

秦 艷1，馮衛(wèi)華1，*，白衛(wèi)東1，2，譚杏婷1，沈 棚1

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院，廣東廣州 510225；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州510642）

目的：利用響應(yīng)面優(yōu)化法對(duì)臍橙皮粗多酚的提取條件進(jìn)行優(yōu)化。方法：在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上選取實(shí)驗(yàn)因素與水平，根據(jù)Box-Behnken Design（BBD）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理采用三因素三水平的響應(yīng)面分析法，依據(jù)回歸分析確定各工藝條件的影響因素，以臍橙皮多酚物質(zhì)含量為響應(yīng)值作響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)。結(jié)果：分析各個(gè)因素的顯著性和交互作用后，得出臍橙皮多酚物質(zhì)浸提的最佳工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)51%、浸提溫度62℃、浸提時(shí)間2h、料液比1∶20（w/v）、浸提2次，臍橙皮多酚物質(zhì)一次提取含量可達(dá)20.2mg/g。結(jié)論：曲面回歸方程與實(shí)驗(yàn)結(jié)果擬合性好，此模型合理可靠，可用于實(shí)際預(yù)測(cè)。

臍橙皮，多酚物質(zhì)，響應(yīng)面分析

Abstract：Objective：The main research object was navel orange peel.Besides，an optimization of extraction process for from navel orange peel was established.Methods：Based on the single factor analysis，a 3-factor，3-level Box-Behnken experimental design was applied to evaluate the effect of the three factors，including extraction temperature，ethanol concentration and ratio of material to liquid.Results：The optimal extraction conditions were ethanol concentration of 51%（v/v），extraction temperature 62℃，extraction time 2h，solid-toliquid ratio 1∶20（w/v） and 2 times for extraction.Temperature was the most important affecting factor of polysaccharide extraction，followed by ethanolconcentration.Under such extraction conditions，the experimental yield of polyphenols obtained after the first extraction was up to 20.2mg/g.Condusion：It was close to predicted value.

Key words：navel orange peel；polyphenols；response surface methodology

臍橙人稱“柑橘之王”[1]，是蕓香科植物甜橙Citrus sinensis（L.）Os-beck栽培品種的成熟果實(shí)，是柑橘品種最優(yōu)良的一個(gè)甜橙種類(lèi)，其營(yíng)養(yǎng)豐富，含有人體所必需的各種營(yíng)養(yǎng)成分。柑橘加工過(guò)程中，皮渣是主要副產(chǎn)品，占總量的20%～40%[2]。臍橙皮渣中含有大量的植物活性成分——多酚，植物多酚為植物體內(nèi)的復(fù)雜酚類(lèi)次生代謝物，主要存在于植物的皮、根、葉、果中，在植物中的含量?jī)H次于纖維素、半纖維素和木質(zhì)素[3]。許多實(shí)驗(yàn)研究資料均顯示，植物多酚具有抗腫瘤、抗病毒、抗衰老等方面的生理活性。多酚的這些生理活性與其具有的清除自由基和抗氧化性能密切相關(guān)[4]。研究表明，多酚的抗氧化能力很強(qiáng)，它在阻止血脂升高的同時(shí)，還可以增加高密度脂蛋白的含量[5]。因此，植物多酚已被稱作人類(lèi)健康的“第7營(yíng)養(yǎng)素”。多酚可用在保健食品中，起到強(qiáng)身健體的功效，也可用于食品中，以延長(zhǎng)食品的貨架期[6]。多酚類(lèi)物質(zhì)能夠明顯抑制多種細(xì)菌、真菌、病毒和潰瘍，控制感染性疾病的發(fā)生[7-9]。同時(shí)，植物多酚在抗誘變、抗腫瘤、抗病毒、抗微生物、抗衰老等方面具有良好的作用，對(duì)一些嚴(yán)重危害人體健康的疾病如高血壓、心臟病、癌癥等具有一定的治療或預(yù)防作用[10-13]。本文在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選用響應(yīng)面優(yōu)化法對(duì)臍橙皮渣中多酚的提取進(jìn)行了優(yōu)化，期望為臍橙皮多酚方面的研究工作者們提供一定的參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

橙皮粉 臍橙，購(gòu)于廣州好有多超市，臍橙手工去皮，除去臍橙皮內(nèi)部纓絡(luò)，將臍橙皮在50℃下恒溫干燥，而后粉碎，過(guò)40目篩，橙皮粉密封后于常溫下保存?zhèn)溆?；沒(méi)食子酸、福林酚試劑 Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO；Na2CO3，無(wú)水乙醇。

DU730型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 美國(guó)BECKMAN COUCTER；HY-2型調(diào)速多用振蕩器 國(guó)華電器有限公司；FA1004型電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；DZKW-4型電熱恒溫水浴鍋 北京中興偉業(yè)儀器有限公司；RE52-C型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鞏義市予華儀器設(shè)備有限公司；800型電動(dòng)離心機(jī) 江蘇金城國(guó)盛實(shí)驗(yàn)儀器廠。

1.2 多酚（TPC）的測(cè)定

1.2.1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 精確稱取沒(méi)食子酸0.50g，定容至100mL容量瓶中，再取此液1mL稀釋至100mL，得濃度為0.05mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。精確量取0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9mL置于10mL的離心管中，對(duì)應(yīng)的沒(méi)食子酸含量分別為5、15、25、35、45μg，分別加入3mL蒸餾水，0.25mL的福林酚，1min后加入20%（w/v）Na2CO3溶液0.75mL混勻，用蒸餾水定容至5mL，混合液于75℃恒溫下水浴10min后，立即冰浴，離心（4500r/min，15min），于760nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度值，以蒸餾水為對(duì)照。用Excel軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以沒(méi)食子酸的含量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，得一元線性回歸方程。

1.2.2 多酚含量的測(cè)定 采用福林-肖卡法[14]。精確移取0.5mL多酚粗提液，按照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方法顯色，于最大吸收波長(zhǎng)760nm處測(cè)吸光度并計(jì)算含量。臍橙皮多酚的含量表示為每克干重樣品中含有的多酚量（以沒(méi)食子酸計(jì)，mg/g）。

1.3 單因素實(shí)驗(yàn)

選用乙醇溶劑浸提法作為提取方法。對(duì)可能影響臍橙皮多酚得率的幾個(gè)因素（乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間和提取溫度）分別做單因素實(shí)驗(yàn)，按照多酚的測(cè)定方法（福林-肖卡法），計(jì)算多酚含量。

1.3.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)的確定 稱取2g左右的臍橙皮粉，分別選用體積分?jǐn)?shù)為30%、40%、50%、60%與70%的乙醇溶液作為提取液，料液比（w/v）：1∶20，在室溫下避光提取3h，過(guò)濾得到濾液，立即測(cè)定其多酚含量。

1.3.2 料液比的確定 稱取2g左右的臍橙皮粉末，選用體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液作為提取液，料液比（w/v）：1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25，在室溫下避光提取3h，過(guò)濾得到濾液，以1∶25所得濾液體積為標(biāo)準(zhǔn)，用60%的乙醇定容至該體積，立即測(cè)定其多酚含量。

1.3.3 提取溫度的確定 稱取2g左右的臍橙皮粉末，選用體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液作為提取液，料液比（w/v）為1∶20，分別在室溫（25℃）、40、50、60、70、80、90℃下避光提取3h，過(guò)濾得到濾液，立即測(cè)定其多酚含量。

4)實(shí)時(shí)交通路況和天氣預(yù)報(bào)技術(shù)。實(shí)時(shí)交通信息除包括城市道路擁堵情況外，還應(yīng)該包括整個(gè)區(qū)域的交通狀況，路面的維修情況，路面情況等。實(shí)時(shí)天氣不僅指當(dāng)年某個(gè)市或縣當(dāng)天的天氣預(yù)報(bào)，還應(yīng)包括即將發(fā)生或者已經(jīng)發(fā)生的災(zāi)害性氣象，出行目的地的天氣狀況等，具備動(dòng)態(tài)的交通和天氣狀況，才能為客貨運(yùn)輸、交通出行帶來(lái)很大方便。

1.3.4 提取時(shí)間的確定 稱取2g左右的臍橙皮粉末，選用體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液作為提取液，料液比（w/v）：1∶20，在室溫下避光分別提取1、2、3、4、5、6h，過(guò)濾得到濾液，立即測(cè)定其多酚含量。

1.4 提取條件的優(yōu)化

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間、提取溫度進(jìn)行綜合考慮，采用三因素三水平，根據(jù)Box-Behnken Design（BBD）設(shè)計(jì)法設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，分析臍橙皮多酚在不同提取條件下的含量，從而優(yōu)化出最佳提取條件。實(shí)驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面因素水平表Table 1 Factors and levels in response surface analysis

1.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

以臍橙皮為材料，采用優(yōu)化的提取條件浸提，過(guò)濾得到濾液，立即測(cè)定提取液中的多酚含量。

1.6 浸提級(jí)數(shù)的確定

以臍橙皮為材料，采用優(yōu)化的提取條件連續(xù)重復(fù)提取三次，立即測(cè)定每次提取液中的多酚含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

采用采用福林-肖卡法繪制沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，得沒(méi)食子酸含量（X）與吸光值（Y）之回歸方程方程Y=0.0182X-0.0444，R2=0.9916。樣品中總酚含量以沒(méi)食子酸含量表示。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)臍橙皮多酚含量的影響 由于乙醇浸提的選擇性好，對(duì)植物細(xì)胞的穿透能力強(qiáng)，浸出率高，提取時(shí)間短，溶解出的雜質(zhì)少，提取物不易霉變，且乙醇毒性小，因此，參照有關(guān)文獻(xiàn)[15]，并在預(yù)備實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上選用乙醇作為提取溶劑。又由于高溫、日照均不利于多酚的穩(wěn)定[16]，因此本研究采用常溫避光提取。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)臍橙皮多酚含量的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on extraction rate of polyphenols from navel orange peel

圖1為在室溫（25℃）、料液比1∶20（w/v）、避光提取3h的條件下，乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)臍橙皮提取液中多酚含量的影響。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)數(shù)達(dá)到50%時(shí)，提取液中多酚含量最大，之后隨著體積分?jǐn)?shù)的增大，含量反而降低。主要是因?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)不同，極性也不同[17]，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%左右時(shí)，可能與臍橙皮多酚的極性相似，故臍橙皮多酚的溶解度最大；而乙醇體積分?jǐn)?shù)偏離50%時(shí)，均不利于臍橙皮多酚的提取。因此，乙醇體積分?jǐn)?shù)選定在50%左右為宜。

圖2 料液比對(duì)臍橙皮多酚含量的影響Fig.2 Effect of material-to-liquid ratio on extraction rate of polyphenols from navel orange peel

2.2.3 提取溫度對(duì)臍橙皮多酚含量的影響 圖3為選用60%乙醇溶液為提取劑，在料液比為1∶20，避光提取3h的條件下，提取溫度對(duì)臍橙皮提取液多酚含量的影響。當(dāng)溫度達(dá)到60℃時(shí)，提取液中多酚的含量達(dá)到最大，之后隨著溫度的升高含量反而降低。溫度是影響提取的重要因素之一。在一定的溫度范圍，提高溫度可能有利于多酚的提??；但是由于多酚中含有大量的酚羥基，其化學(xué)性質(zhì)及其活潑，某些酚類(lèi)物質(zhì)在較高的溫度下不穩(wěn)定[19]，故當(dāng)提取溫度超過(guò)60℃時(shí)，臍橙皮多酚的含量隨著溫度的升高反而降低。Antolovich[19]的研究也發(fā)現(xiàn)，當(dāng)溫度達(dá)到60℃后，多酚提取含量顯著下降。因此，臍橙皮多酚的提取溫度選為60℃左右。

圖3 溫度對(duì)臍橙皮多酚含量的影響Fig.3 Effect of temperature on extraction rate of polyphenols from navel orange peel

2.2.4 提取時(shí)間對(duì)臍橙皮多酚含量的影響 圖4為選用60%乙醇溶液作為提取劑、在室溫（25℃）、料液比1∶20的條件下，提取時(shí)間對(duì)臍橙皮提取液多酚含量的影響。臍橙皮提取液中多酚含量在2、3、4、5h時(shí)顯著高于1h（p＜0.05）；當(dāng)提取時(shí)間超過(guò)2h后，延長(zhǎng)提取時(shí)間，提取液中多酚含量無(wú)顯著差異（p＜0.05），但呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，故延長(zhǎng)提取時(shí)間有利于多酚的提取。但是由于多酚易氧化[20]，提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)反而會(huì)破壞多酚類(lèi)物質(zhì)的酚羥基結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其得率降低[21]。因此，提取時(shí)間選定為2h。

圖4 提取時(shí)間對(duì)臍橙皮多酚含量的影響Fig.4 Effect of time on extraction rate of polyphenols from navel orange peel

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化臍橙皮多酚提取工藝

2.3.1 響應(yīng)面分析因素水平的選取 根據(jù)Box-Behnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，結(jié)合上述單因素影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、料液比（B）和提取溫度（C）3個(gè)影響因素，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用三因素三水平的響應(yīng)曲面分析方法，共15個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)。由Box-Behnken Design設(shè)計(jì)方案所得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 Box-Behnken設(shè)計(jì)方案及其響應(yīng)值Table 2 Box-Behnken experimental design and corresponding experimental polysaccharide yields

2.3.2 數(shù)學(xué)模型及其顯著性檢驗(yàn) 按照Design Expert軟件中的Box-Behnken Design模型對(duì)表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到多酚含量對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、液料比（B）、提取溫度（C）的二次多項(xiàng)回歸模型為：Y=20.14+0.32A+0.49B+0.64C-3.16A2-1.57B2-1.53C2-0.022AB+0.27AC-0.24BC，對(duì)該模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3，回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)見(jiàn)表4。

表3 多酚提取回歸模型的方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance for quadratic polynomial modeI of polyphonoI extraotion

表4 多酚提取回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果Table 4 Test result of significance for regression coefficient of polyphenol extraction

由表3可知，整體模型顯著性水平p＜0.01，表明二次方程模型達(dá)到極顯著水平；同時(shí)失擬項(xiàng)p=0.0681＞0.05，表明差異不顯著，說(shuō)明殘差均由隨機(jī)誤差引起。由表4可知，調(diào)整系數(shù)R2=0.9967，說(shuō)明響應(yīng)值的變化有99.67%來(lái)源于所選變量，即提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比；相關(guān)系數(shù)R為0.9983，表明實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值高度相關(guān)。綜合以上所述，說(shuō)明模型擬合程度良好，實(shí)驗(yàn)誤差小。因此，該模型可較好地描述各因數(shù)與相應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系，可利用模型來(lái)分析和預(yù)測(cè)臍橙皮多酚的提取工藝結(jié)果。

由表4回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果可知，回歸方程的一次項(xiàng)A、B、C顯著，并且可看出影響順序?yàn)椋篊＞B＞A，即：提取溫度＞料液比＞乙醇體積分?jǐn)?shù)；二次項(xiàng)A2、B2、C2極顯著；交互項(xiàng)除AC外，其他均不顯著（p＞0.05）。

2.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化與分析 利用Design Expert 7.1.6軟件，繪制各影響因素對(duì)臍橙皮多酚含量的響應(yīng)曲面圖，考察所擬合的響應(yīng)面的形狀，分析乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、料液比（B）和提取溫度（C）對(duì)臍橙皮多酚含量的影響。如果一個(gè)響應(yīng)曲面坡度相對(duì)平緩，表明其可以忍受處理?xiàng)l件的變異，而不影響到響應(yīng)值的大小，相反，如果一個(gè)響應(yīng)曲面坡度異常陡峭，表明響應(yīng)值對(duì)于處理?xiàng)l件的改變非常敏感[22]。

比較圖5～圖7可知，乙醇濃度、料液比和提取時(shí)間對(duì)臍橙皮多酚含量的影響極為顯著，表現(xiàn)為曲面較陡，其中提取溫度對(duì)臍橙皮多酚含量的影響最大。另外，結(jié)合等高線的疏密程度可看出，圖6響應(yīng)面曲面較陡且等高線較緊密，故乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取溫度之間的交互作用比較強(qiáng)，而乙醇體積分?jǐn)?shù)與料液比、料液比與提取溫度之間兩兩交互作用比較弱。

圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)與料液比對(duì)多酚含量的影響Fig.5 Effect of ethanol concentration and material-to-liquid ratio on extraction rate of polyphenols

圖6 乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取溫度對(duì)多酚含量的影響Fig.6 Effect of ethanol concentration and extracting temperature on extraction rate of polyphenols

圖7 提取溫度與料液比對(duì)多酚含量的影響Fig.7 Effect of extracting temperature and extracting time on extraction rate of polyphenols

2.3.4 優(yōu)化與驗(yàn)證 從上述回歸模型中求得最優(yōu)工藝條件為體積分?jǐn)?shù)50.58%，料液比1∶20.69，溫度62.01℃，臍橙皮提取液多酚含量的理論值為20.24mg/g。由于以上最佳條件未包括在響應(yīng)面優(yōu)化的15組實(shí)驗(yàn)中，需進(jìn)一步進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。為了操作方便，將以上條件修正為乙醇體積分?jǐn)?shù)51%、提取溫度62℃、料液比1∶20。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在最佳提取條件下，臍橙皮提取液多酚含量為20.2mg/g（RSD=0.58%），與預(yù)測(cè)值相差不大，說(shuō)明該方程與實(shí)際情況擬合很好，充分驗(yàn)證了所建模型的正確性，說(shuō)明響應(yīng)面法適用于臍橙皮多酚提取工藝進(jìn)行回歸分析和參數(shù)優(yōu)化。

2.4 浸提次數(shù)的確定

圖8 浸提次數(shù)對(duì)臍橙皮多酚含量的影響Fig.8 Effect of extraction number on extraction rate of polyphenols from navel orange peel

圖8為選用51%乙醇溶液為提取液，在溫度62℃、提取2h、料液比1∶20的條件下連續(xù)重復(fù)提取臍橙皮多酚3次，測(cè)定每次提取液的多酚含量。每次提取占總的多酚提取量的比例分別為72.10%、18.58%和9.33%。前兩次提取的多酚量占總提取量的90.67%。因此，本研究確定浸提次數(shù)為2次。

3 結(jié)論

在單因素的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，運(yùn)用響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方法，結(jié)合回歸模型的數(shù)學(xué)分析，對(duì)臍橙皮多酚提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化。通過(guò)實(shí)驗(yàn)得到的最優(yōu)工藝參數(shù)為乙醇體積分?jǐn)?shù)51%、浸提溫度62℃、浸提時(shí)間2h、料液比1∶20（w/v）、浸提2次，在此條件下，臍橙皮多酚得率可達(dá)20.2mg/g。

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Optimization of polyphenol extraction from navel orange peel by response surface methodology

QIN Yan1，F(xiàn)ENG Wei-hua1，*，BAI Wei-dong1，2，TAN Xing-ting1，SHEN Peng1
（1.College of Light Industry and Food，Zhongkai University of Agriculture and Engineering，Guangdong Guangzhou 510225，China；2.College of Food Science，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China）

TS201.2

B

1002-0306（2012）20-0231-06

2012-06-27 *通訊聯(lián)系人

秦艷（1986-），女，在讀研究生，研究方向：果蔬貯藏與加工、生物活性成分提取純化及功能分析。

廣東省教育部產(chǎn)學(xué)研結(jié)合項(xiàng)目（2010B090400257）；廣東省科技計(jì)劃農(nóng)業(yè)攻關(guān)項(xiàng)目（2011A020202010）；廣東省科技計(jì)劃社會(huì)發(fā)展項(xiàng)目（2011B031000001）。