王晨浩，徐 珺，王文梅，張偉云

南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院 江蘇省醫(yī)學(xué)分子技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210093

越來越多的實(shí)驗(yàn)證明，從高等植物、微生物或藻類提取的多糖具有良好的抗氧化、抗腫瘤、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)活性[1-4]。蟲草菌多糖是冬蟲夏草（Cordyceps sinensis）的主要活性成分之一，具有多種生物活性。野生冬蟲夏草分布地域狹窄、資源稀少，需求量極大。研究發(fā)現(xiàn)，蟲草菌絲體的藥理作用與野生冬蟲夏草相似，且易于大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)。本課題組從一株蟲草無性型真菌的發(fā)酵液中分離純化出胞外多糖（EPS）并且已發(fā)現(xiàn)其具有免疫調(diào)節(jié)作用[5]。我們之前的研究表明，蟲草菌多糖可抑制荷瘤小鼠體內(nèi)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，且進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明這一抑制作用是通過EPS調(diào)節(jié)小鼠體內(nèi)的免疫系統(tǒng)和提高其抗氧化能力來發(fā)揮作用的[5-6]。

樹突狀細(xì)胞（DC）是機(jī)體專職抗原遞呈細(xì)胞，它在機(jī)體的特異性免疫和非特異性免疫中發(fā)揮著重要的橋梁作用，且它是機(jī)體免疫反應(yīng)的重要啟動者，對于調(diào)節(jié)和維持機(jī)體內(nèi)免疫系統(tǒng)的平衡與穩(wěn)定有著重要的作用。在吸煙引起的相關(guān)疾病如慢性阻塞性肺病和肺癌的發(fā)病過程中樹突狀細(xì)胞起著重要的作用[7-8]。

吸煙造成的氧化應(yīng)激損害機(jī)體的免疫防御功能已被廣泛認(rèn)可，本文首次研究蟲草菌多糖（EPS）對于吸煙引起的樹突狀細(xì)胞的氧化損傷的保護(hù)作用。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

南京（精品）香煙（南京卷煙廠，焦油:12 mg/支、尼古丁:1.2 mg/支）；DCS細(xì)胞系（北京協(xié)和醫(yī)科大學(xué)）；胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；MTT、二甲基亞砜（DMSO）、DCFH-DA（美國Sigma公司）；CAT試劑盒、SOD試劑盒和LDH試劑盒（南京建成科技有限公司）；其它試劑均為生化試劑或分析純。

1.2 儀器

TE2000-S倒置相差顯微鏡（日本Nikon公司）；FACS Cailbur流式細(xì)胞儀（美國Becton-Dickson公司）；MCO-15AC二氧化碳培養(yǎng)箱（日本Sanyo公司）；Model-550酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad公司）；Heraeus Fersco 17高速冷凍離心機(jī)（美國Thermo公司）。

2 方 法

2.1 EPS的制備

按照本實(shí)驗(yàn)室建立的方法進(jìn)行真菌發(fā)酵培養(yǎng)。收集蟲草菌發(fā)酵液，制備胞外多糖EPS[5]。EPS為均一多糖，其分子量為1.04×105，糖基組成為甘露糖-葡萄糖-半乳糖（23∶1∶2.6）。

2.2 香煙提取物的制備

將點(diǎn)燃的香煙通過吸煙泵導(dǎo)入RPMI-1640培養(yǎng)基，每支煙溶于10 mL培養(yǎng)液，通過調(diào)節(jié)流速控制一支煙在5 min左右燃完，過濾除菌即制得100%的煙提取物（CSE），于-20℃保存?zhèn)溆?。使用時(shí)按比例用培養(yǎng)基稀釋。

2.3 MTT法測定香煙提取物對DCS細(xì)胞增殖的影響

取對數(shù)生長的DCS細(xì)胞，調(diào)整為以1×105·mL-1，接種于96孔培養(yǎng)板，100 μL/孔，貼壁。加入不同濃度的CSE，在培養(yǎng)液中終濃度分別為0%、3.75%、7.5%、15%、30%（原提取物為100%）。設(shè)5個(gè)平行孔，培養(yǎng) 48 h。加 10 μL MTT（5 mg·mL-1），培養(yǎng) 4 h，然后加入10%十二烷基硫酸鈉（SDS）過夜，用酶標(biāo)儀于570 nm處測定OD值。

2.4 香煙提取物對DCS的作用及ROS含量測定

將 DCS 細(xì)胞（1×105·mL-1）接種于 24 孔板，1 mL/孔，貼壁。加入不同濃度CSE，設(shè)4個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng) 48 h。胰酶消化，收集細(xì)胞，離心（1000 r·min-1，10 min）去上清液，加入 DCFH-DA（150 μL/管，終濃度為 10 μmol·L-1），室溫避光孵育 30 min。添加 PBS（300 μL/管），用流式細(xì)胞儀檢測10000個(gè)細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA平均熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長530 nm，用FLOWJO軟件分析數(shù)據(jù)。

2.5 EPS對DCS的保護(hù)后ROS含量測定

將 DCS 細(xì)胞（1×105·mL-1）接種于 24 孔板，1 mL/孔，貼壁。加不同濃度藥物 EPS（12.5、25、50、100 μg·mL-1），設(shè) 4 個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng) 24 h 后加 7.5%CSE，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。胰酶消化，收集細(xì)胞，離心（1000 r·min-1，10 min）去上清液，同上述方法檢測細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA平均熒光強(qiáng)度。

2.6 EPS保護(hù)后DCS細(xì)胞乳酸脫氫酶（LDH）的測定

DCS 細(xì)胞稀釋成 1×105·mL-1，接種于 24 孔板，1 mL/孔，貼壁。加不同濃度 EPS（12.5、25、50、100 μg·mL-1），設(shè) 4 個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng) 24 h 加 7.5%CSE（7.5%CES可引起ROS顯著增加）處理24 h。吸取培養(yǎng)上清液用于LDH活檢測。測定方法參照試劑盒說明書。

2.7 EPS保護(hù)后DCS細(xì)胞過氧化氫酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）活力的測定

DCS 細(xì)胞稀釋成 1×105·mL-1，接種于 24 孔板，1 mL/孔，貼壁。加不同濃度藥物 EPS（12.5、25、50、100 μg·mL-1），設(shè) 4 個(gè)復(fù)孔，作用 24 h 后加 7.5%CSE處理24 h，然后換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后收集細(xì)胞，用PBS洗兩遍，重懸于0.2 mL 0.1 mol·L-1PBS（含 0.05 mmol·L-1EDTA）中，反復(fù)凍融3 次，4℃ 10200 r·min-1離心 30 min，取上清液用于CAT、SOD檢測。測定方法參照試劑盒說明書。

2.8 統(tǒng)計(jì)方法

3 結(jié) 果

3.1 香煙提取物對DCS細(xì)胞增殖的抑制作用

香煙提取物作用DCS細(xì)胞48 h后，其增殖能力明顯受抑制，在30%CSE作用下，具有顯著抑制作用（P＜0.05），見圖 1。

圖1 香煙提取物對DCS細(xì)胞增殖能力的影響

3.2 香煙提取物對DCS細(xì)胞ROS產(chǎn)生的影響

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果如圖2所示。香煙提取物作用DCS細(xì)胞48 h后，其ROS產(chǎn)生水平在CSE濃度為7.5%、15%和30%時(shí)有顯著增加（P＜0.05），且呈劑量依賴關(guān)系。

圖2 香煙提取物對DCS細(xì)胞ROS水平的影響

3.3 EPS對DCS細(xì)胞ROS產(chǎn)生的保護(hù)作用

EPS與DCS細(xì)胞共同孵育24 h后，在25、50、100 μg·mL-1劑量組ROS產(chǎn)生的量明顯降低，可以抵抗煙引起的ROS增加（見圖3）。

圖3 EPS對CSE誘導(dǎo)DCS細(xì)胞產(chǎn)生的ROS的抑制作用

3.4 EPS對DCS細(xì)胞LDH過度釋放的保護(hù)作用

LDH是廣泛存在于細(xì)胞中參與能量代謝的一類重要酶。LDH的過度釋放是細(xì)胞受損的一個(gè)重要指標(biāo)。如圖4所示，由于煙的傷害導(dǎo)致DCS細(xì)胞釋放到細(xì)胞外的LDH活性顯著提高（P＜0.001）。而采用EPS預(yù)孵育24 h，則顯著降低了LDH的水平（12.5 μg·mL-1和 25 μg·mL-1，P＜0.05；50 μg·mL-1，P＜0.01；100 μg·mL-1，P＜0.001），且呈濃度依賴關(guān)系。

圖4 EPS對CSE誘導(dǎo)DCS細(xì)胞產(chǎn)生的LDH的抑制作用

3.5 EPS對DCS細(xì)胞CAT產(chǎn)生的保護(hù)作用

CAT是胞內(nèi)催化H2O2分解的一類重要的抗氧化酶。如圖5所示，CSE的處理損耗了胞內(nèi)大量的CAT（P＜0.001），使 CAT 活性從 0.23 U·（mg prot）-1下降到 0.03 U·（mg prot）-1，而 EPS 的預(yù)處理，緩解了CAT活性的下降，效果極其顯著（P＜0.001）。

圖5 EPS對CSE處理的DCS細(xì)胞的CAT活性的影響

3.6 EPS對DCS細(xì)胞SOD產(chǎn)生的保護(hù)作用

SOD可以清除超氧陰離子自由基，從而保護(hù)細(xì)胞免受損傷。如圖6所示，CSE處理之后，細(xì)胞內(nèi)SOD活性顯著下降（P＜0.001），EPS預(yù)處理后對胞內(nèi)SOD活力有非常顯著地提升（P＜0.001）。

圖6 EPS對CSE處理的DCS細(xì)胞的SOD活性的影響

4 討 論

氧是人正常代謝所必須的成分，在人體中，需要用氧參與體內(nèi)很多反應(yīng)以維持生命。但在反應(yīng)過程中，會產(chǎn)生一系列的活性氧（reactive oxygen species，ROS）。在正常的生理狀態(tài)下，ROS會在抗氧化酶及外源性和內(nèi)源性的抗氧化劑的作用下處于生成與清除的動態(tài)平衡中，維持在極低水平，發(fā)揮其正常的生理功能[9]。但在內(nèi)源性或外源性的刺激下，使機(jī)體代謝異常而驟然產(chǎn)生大量的ROS，或機(jī)體抗氧化防御能力不足時(shí)，則使得機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，導(dǎo)致細(xì)胞可逆或不可逆的損傷，引起細(xì)胞凋亡或壞死[10]。

已有研究顯示，吸煙可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS升高，高濃度的ROS在細(xì)胞內(nèi)可以攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，使細(xì)胞質(zhì)膜損傷，乳酸脫氫酶泄露，并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[11]。本實(shí)驗(yàn)使用CSE誘導(dǎo)損傷的DCS，觀察EPS對氧化應(yīng)激下細(xì)胞的保護(hù)作用。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CSE作用于DCS后，細(xì)胞的存活率明顯下降且LDH釋放量上升，說明CSE導(dǎo)致DCS細(xì)胞明顯損傷；而使用EPS預(yù)處理后，細(xì)胞LDH釋放量和ROS水平都顯著降低，說明細(xì)胞所受損傷減輕，證實(shí)EPS對氧化損傷狀態(tài)下的DCS有保護(hù)作用。CAT、SOD是廣泛存在于組織細(xì)胞中抗氧化酶類，可以通過清除過多的活性氧，保持胞內(nèi)的氧化平衡，避免細(xì)胞氧化損傷[12]。在本實(shí)驗(yàn)中CSE作用24 h可使DCS細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性明顯下降，其下降趨勢可以被不同濃度的EPS減弱。這些結(jié)果表明，EPS對DCS細(xì)胞的氧化應(yīng)激有保護(hù)作用，并且其保護(hù)作用與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性有關(guān)。

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