劉慧慧，姜立，張成明，張建華，毛忠貴

1(江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫，214122)

2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122)

“酒精沼氣雙發(fā)酵耦聯(lián)工藝”中硫化物對(duì)酒精發(fā)酵的影響*

劉慧慧1，2，姜立1，2，張成明1，2，張建華1，2，毛忠貴1，2

1(江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫，214122)

2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122)

“酒精沼氣雙發(fā)酵耦聯(lián)工藝”中硫化物會(huì)對(duì)酒精發(fā)酵產(chǎn)生抑制，不利于工藝的穩(wěn)定運(yùn)行。與對(duì)照相比，pH 4.0，24 mmol/L的硫化物使酒精發(fā)酵時(shí)間從48 h延長(zhǎng)至318 h，酒精產(chǎn)量由90.73 g/L下降至82.28 g/L，酵母數(shù)量由3.78×108/mL下降至2.20×108/mL，甘油產(chǎn)量由6.99 g/L上升至11.02 g/L。甘油產(chǎn)量上升是硫化物存在時(shí)酒精產(chǎn)量下降的原因之一。硫化物對(duì)酒精發(fā)酵的抑制性隨添加時(shí)間的推遲而減弱，這是因?yàn)樵诰凭l(fā)酵過(guò)程中，硫化物會(huì)以H2S的形式隨著CO2一起從發(fā)酵液逸出。pH 4.0時(shí)，硫化物對(duì)酒精發(fā)酵的臨界抑制濃度為1.2 mmol/L。

木薯，燃料酒精，硫酸根，硫化物，臨界抑制濃度

木薯是世界上最大的能源作物之一，正逐漸成為我國(guó)非糧燃料酒精生產(chǎn)的主要原料。蒸餾廢液治理問(wèn)題已成為木薯燃料酒精進(jìn)一步發(fā)展的“瓶頸”問(wèn)題，亟需解決。利用傳統(tǒng)的“厭氧好氧”生物技術(shù)處理蒸餾廢液具有投資大、運(yùn)行費(fèi)用高，以及處理不徹底等缺點(diǎn)，因此很多學(xué)者對(duì)酒精蒸餾廢液回用工藝進(jìn)行了研究[1-4］。通常情況下，蒸餾廢液的回用比不能超過(guò)30%，否則會(huì)造成酒精產(chǎn)量的下降[5］。

為了解決蒸餾廢液污染問(wèn)題，根據(jù)清潔生產(chǎn)理論并結(jié)合本研究室在酒精生產(chǎn)方面積累的經(jīng)驗(yàn)，提出了木薯燃料酒精的“酒精沼氣雙發(fā)酵耦聯(lián)”工藝(圖1)。在該工藝中，采用高溫-中溫兩級(jí)串聯(lián)厭氧沼氣發(fā)酵系統(tǒng)來(lái)處理蒸餾廢液，中溫厭氧出水作為下一批次酒精發(fā)酵的配料水進(jìn)行回用，從而解決了蒸餾廢液的污染問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)了木薯燃料酒精生產(chǎn)的無(wú)廢(水)制造。在“酒精沼氣雙發(fā)酵耦聯(lián)”工藝中，擯除了運(yùn)行成本高的好氧生物處理工藝，降低了污水治理成本;對(duì)厭氧出水進(jìn)行回用還可以節(jié)約大量寶貴的水資源，因而具有良好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益[6-8］。

在“酒精沼氣雙發(fā)酵耦聯(lián)”工藝中，中溫厭氧出水(pH 7.8～8.2)被用作配料水，配料結(jié)束后，料液pH通常在7.0以上，偏離了液化酶作用的最佳pH范圍(6.0～6.4)。為了保證良好的液化效果就必須對(duì)料液加酸進(jìn)行調(diào)節(jié)。厭氧出水強(qiáng)大的緩沖能力(堿度通常在3000～4000 mg/L CaCO3)大大增加了料液pH調(diào)節(jié)時(shí)的硫酸使用量。SO42-在酒精發(fā)酵過(guò)程中處于“惰性”狀態(tài)，不會(huì)對(duì)酵母生長(zhǎng)和酒精發(fā)酵產(chǎn)生影響。而蒸餾廢液中的SO42-會(huì)在沼氣發(fā)酵過(guò)程中被還原為硫化物[(方程(1)～(3))］，而硫化物對(duì)酒精發(fā)酵具有潛在的危害。

圖1 木薯“酒精沼氣雙發(fā)酵耦聯(lián)工藝”流程圖

在厭氧出水中(pH 7.8～8.2)，硫化物主要以S2-和HS-的形式存在[9］。但在酒精發(fā)酵條件下(pH 4.0～5.0)，硫化物主要以H2S形式存在。當(dāng)電中性的H2S分子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)時(shí)，會(huì)破壞細(xì)胞的蛋白質(zhì)，進(jìn)而抑制微生物的生長(zhǎng);H2S還可以通過(guò)形成硫鏈來(lái)干擾代謝輔酶A和輔酶M，進(jìn)而影響微生物的生長(zhǎng)和代謝。在傳統(tǒng)酒精生產(chǎn)中，硫化物不會(huì)對(duì)酒精發(fā)酵產(chǎn)生抑制，因此，未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本文的目的在于通過(guò)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)硫化物對(duì)酒精發(fā)酵產(chǎn)生抑制的臨界濃度，為“酒精沼氣雙發(fā)酵耦聯(lián)”工藝中配料水(厭氧出水)的水質(zhì)控制提供數(shù)據(jù)支撐;同時(shí)對(duì)硫化物抑制酒精發(fā)酵的機(jī)理做初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 木薯

河南天冠集團(tuán)有限公司提供。

1.1.2 菌種

Saccharomyces cerevisiae，安琪酵母股份有限公司生產(chǎn)。

1.1.3 主要試劑和藥品

液體耐高溫α-淀粉酶(20000 U/mL)、液體糖化酶(130000 U/mL)，無(wú)錫杰能科生物工程有限公司產(chǎn)品。其它試劑均為分析純或優(yōu)級(jí)純市售商品。

1.1.4 種子培養(yǎng)基(g/L)

葡萄糖 20，酵母膏 8.5，NH4Cl 1.3，MgSO4·7H2O 0.1，CaCl20.06，pH 自然，0.08 MPa滅菌 15 min。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 種子培養(yǎng)

接1環(huán)生長(zhǎng)良好的斜面酵母至200 mL種子培養(yǎng)基中，30℃，200 r/min培養(yǎng)20 h。

3.1.4 豬的室間隔缺損模型 這類(lèi)模型非常重要，由于這類(lèi)疾病模型屬于自然發(fā)生，能夠有效模擬人類(lèi)收縮功能正常的心力衰竭模型[18-19]。

1.2.2 液化

將木薯粉碎，過(guò)40目篩，料水比為1∶3(g∶mL)。物料混合均勻后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的H2SO4溶液調(diào)pH至6.0，按10 U/g木薯粉加入耐高溫α-淀粉酶，于沸水浴中液化，冷卻后用稀碘液作指示劑判斷液化終點(diǎn)。

1.2.3 糖化與發(fā)酵

將1.2.2中得到的液化液冷卻至60℃，用30%H2SO4調(diào)節(jié)料液pH至實(shí)驗(yàn)設(shè)定pH，分裝于三角瓶，0.08 MPa條件下滅菌15 min;滅菌后冷卻至30℃，按130 U/mL培養(yǎng)基添加糖化酶，接入10%(v/v)酵母種子液和0.5 g/L尿素，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)定添加一定量的Na2S溶液，于30℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置發(fā)酵。

1.3 分析方法

酒精、甘油、葡萄糖含量利用高效液相色譜檢測(cè)，檢測(cè)儀器及色譜條件為:美國(guó)Dionex UltiMate 3000 HPLC，示差折光檢測(cè)器，日本 Shodex RI-101，紫外檢測(cè)器Dionex UltiMate 3000，分析柱Bio-Rad HPX-87 H離子交換柱，柱溫60℃，流動(dòng)相0.005 mol/L稀H2SO4，流速 0.6 mL/min，進(jìn)樣量 20 μL。

酵母數(shù)測(cè)定:血球計(jì)數(shù)板法。

硫化物含量測(cè)定:甲基藍(lán)比色法[10］。

2 結(jié)果與討論

2.1 硫化物對(duì)酒精發(fā)酵臨界抑制濃度的確定

在發(fā)酵起始pH 4.0條件下，考察了硫化物對(duì)酒精發(fā)酵的臨界抑制濃度。實(shí)驗(yàn)中添加的硫化物(Na2S)濃度分別為 0、1.2、2.4、3.6、4.8 和 6.0 mmol/L，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

圖2 硫化物對(duì)酒精發(fā)酵過(guò)程中CO2生成量的影響

隨著培養(yǎng)中硫化物濃度的增加，酒精發(fā)酵時(shí)間不斷延長(zhǎng)(圖2)。與對(duì)照相比，硫化物濃度為1.2 mmol/L時(shí)，發(fā)酵時(shí)間沒(méi)有延遲;而當(dāng)硫化物濃度為6.0 mmol/L時(shí)，發(fā)酵時(shí)間從對(duì)照的48 h延長(zhǎng)至60 h。從CO2生成曲線(xiàn)上看，為避免硫化物對(duì)酒精發(fā)酵產(chǎn)生抑制，培養(yǎng)基中硫化物的濃度不能超過(guò)1.2 mmol/L。為了探索S2-對(duì)酒精發(fā)酵抑制的機(jī)理，考察了不同起始pH條件下，S2-對(duì)酒精發(fā)酵中CO2生成、酒精產(chǎn)量、甘油產(chǎn)量以及生物量的影響;此外，還考察了添加時(shí)間對(duì)S2-抑制性的影響。

2.2 不同初始pH值下硫化物對(duì)酒精發(fā)酵的影響

根據(jù)酵母生長(zhǎng)和酒精發(fā)酵條件，實(shí)驗(yàn)中確定的pH分別為4.0、5.0和6.0，硫化物濃度分別為0、6、12、18和24 mmol/L，每組3個(gè)平行，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

在所有pH條件下，S2-均造成了酒精發(fā)酵啟動(dòng)的延遲，這種延遲現(xiàn)象隨著S2-濃度增大以及培養(yǎng)基pH的下降而更加顯著(圖3)。例如，當(dāng)發(fā)酵初始pH為4.0，S2-濃度分別為 0、6、12、18、24 mmol/L 時(shí)，酒精發(fā)酵起始時(shí)間分別延遲了0、12、72、174和252 h;當(dāng)硫化物濃度為12 mmol/L時(shí)，隨著培養(yǎng)基pH由6.0下降至4.0，酒精發(fā)酵起始時(shí)間從24 h延長(zhǎng)至72 h。在酒精發(fā)酵過(guò)程中，酵母的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期與CO2生成基本是同步的，這說(shuō)明，硫化物抑制了酵母的生長(zhǎng)。從CO2生成曲線(xiàn)上看，硫化物只是推遲了酒精發(fā)酵開(kāi)始的時(shí)間，而對(duì)酒精發(fā)酵時(shí)CO2的生成速率沒(méi)有明顯影響。這意味著，硫化物存在時(shí)，酒精發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)主要是由于酒精發(fā)酵啟動(dòng)被延遲造成的。

圖3 不同發(fā)酵初始pH時(shí)硫化物對(duì)酒精發(fā)酵過(guò)程中CO2生成的影響

H2S是一種二元弱酸，在溶液中分子態(tài)形式的比例主要由環(huán)境pH所決定，計(jì)算公式:

根據(jù)計(jì)算結(jié)果，在硫化物濃度一定時(shí)，H2S占總硫化物的比例隨著環(huán)境pH的下降而增高(表1)，這也是低pH條件下，硫化物抑制性更強(qiáng)的原因。需要指出的是，由于H2S的pKa1較大，即使環(huán)境pH為6.0時(shí)，H2S占總硫化物的比例也超過(guò)91.8%，這也是高pH條件下硫化物依然顯示出很強(qiáng)抑制性的原因。

表1 不同pH條件下培養(yǎng)基中硫化物濃度與其對(duì)應(yīng)的H2S濃度

硫化物存在時(shí)，不僅會(huì)明顯延長(zhǎng)酒精發(fā)酵時(shí)間，而且對(duì)酒精發(fā)酵中的產(chǎn)物具有明顯影響，表現(xiàn)為酒精產(chǎn)量和生物量下降以及甘油產(chǎn)量的上升(表2)。以發(fā)酵初始pH為5.0為例，當(dāng)S2-添加量從0 mmol/L增加到24 mmol/L時(shí)，酒精產(chǎn)量由90.46 g/L下降至85.06 g/L，下降6.0%;酵母數(shù)量由4.57×108/mL下降至1.93×108/mL，下降57.8%;甘油產(chǎn)量由6.93 g/L增加至10.55 g/L，增加52.2%。硫化物可以抑制酵母生長(zhǎng)，并減少酒精合成，但是顯著促進(jìn)了甘油的生成。酵母數(shù)量的減少主要是因?yàn)镠2S的存在抑制了其生長(zhǎng)，前期研究表明，高濃度硫化物存在時(shí)甚至?xí)斐山湍讣?xì)胞破裂死亡[12］。通常認(rèn)為，甘油的生產(chǎn)與生物量成正相關(guān)關(guān)系，但硫化物存在，生物量的下降并未造成甘油的下降，其原因需要進(jìn)一步分析。

表2 不同初始pH條件下硫化物對(duì)酒精發(fā)酵的影響

2.2 硫化物的添加時(shí)間對(duì)酒精發(fā)酵的影響

為了進(jìn)一步確定S2-對(duì)酒精發(fā)酵的抑制機(jī)理，確定抑制酒精發(fā)酵的具體階段，設(shè)定在發(fā)酵不同時(shí)間向培養(yǎng)基中添加一定濃度的S2-。研究接種后0 h、6 h、12 h時(shí)加入S2-，每組3個(gè)平行。硫化物添加濃度為12 mmol/L(發(fā)酵起始pH 4.0及5.0)和24 mmol/L(發(fā)酵起始pH 6.0)，發(fā)酵過(guò)程中CO2產(chǎn)量變化如圖4所示。

由圖4可知，不同發(fā)酵初始pH條件下，S2-對(duì)酒精發(fā)酵的影響呈現(xiàn)出了相同的規(guī)律。接種后加入S2-的時(shí)間越早對(duì)酒精發(fā)酵的抑制作用越強(qiáng)，一旦體系中加入了S2-，培養(yǎng)基CO2生成量即與對(duì)照產(chǎn)生差異。以6 h時(shí)添加S2-為例，添加硫化物前，CO2生成量變化曲線(xiàn)與對(duì)照完全重合;添加S2-后培養(yǎng)基CO2生成量明顯較對(duì)照減少。接種后12 h添加S2-的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)也表現(xiàn)出相同規(guī)律。結(jié)果同時(shí)表明，硫化物對(duì)酒精發(fā)酵的抑制性隨著添加時(shí)間的推遲而減弱。例如，當(dāng)初始pH為4.0時(shí)，硫化物添加時(shí)間為0 h時(shí)，到接種后80 h才開(kāi)始酒精發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)達(dá)126 h，而當(dāng)硫化物添加時(shí)間為接種后12 h，CO2生成速度略有減慢，發(fā)酵時(shí)間縮短至72 h。這種變化規(guī)律表明，S2-的加入會(huì)嚴(yán)重影響酵母細(xì)胞的增殖。發(fā)酵初期酵母會(huì)大量繁殖滿(mǎn)足發(fā)酵生產(chǎn)需要，而在發(fā)酵進(jìn)行一段時(shí)間后，酵母的生長(zhǎng)繁殖相對(duì)穩(wěn)定，添加S2-對(duì)發(fā)酵的影響大大減小。說(shuō)明S2-主要的影響體現(xiàn)在對(duì)酵母增殖上，而不是發(fā)酵性能上。

表3所示為不同發(fā)酵初始pH條件下，在發(fā)酵不同時(shí)間添加相同濃度的S2-對(duì)酒精發(fā)酵的影響。結(jié)果顯示，與對(duì)照相比，隨著添加時(shí)間的推后，酒精產(chǎn)量逐漸增大，甘油產(chǎn)量越少。說(shuō)明培養(yǎng)基中的S2-對(duì)酒精發(fā)酵的影響主要在發(fā)酵的前期，而發(fā)酵的前期主要是酵母大量繁殖的過(guò)程，由此也可以看出，是由于酵母的生長(zhǎng)受到了抑制而導(dǎo)致酒精發(fā)酵異常。而且，在發(fā)酵開(kāi)始后加入S2-已經(jīng)有CO2產(chǎn)生，產(chǎn)生的可以將H2S部分帶出，減少發(fā)酵培養(yǎng)基中殘留的H2S進(jìn)而減輕了H2S對(duì)酒精發(fā)酵的抑制作用[13］。

3 結(jié)論

同一發(fā)酵初始pH值下，隨著S2-濃度的增大抑制現(xiàn)象越明顯。表現(xiàn)為在初始pH為4.0時(shí)，S2-濃度從6 mmol/L增加到24 mmol/L時(shí)，發(fā)酵延遲時(shí)間從20 h延長(zhǎng)到260 h左右，發(fā)酵結(jié)束時(shí)酵母數(shù)減少量可達(dá)50%，酒精產(chǎn)量減少了8.5 g/L。不同發(fā)酵初始pH值加入等濃度S2-的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)對(duì)比可以得到，pH值越小對(duì)發(fā)酵的抑制作用越強(qiáng)。同樣加入24 mmol/L的S2-，pH值為4.0和6.0時(shí)發(fā)酵延遲時(shí)間分別為260 h左右和110 h左右。而當(dāng)pH值越低等濃度的S2-轉(zhuǎn)化為H2S的量就越多，說(shuō)明對(duì)酵母發(fā)酵有抑制作用的是H2S。

由同一發(fā)酵初始pH值在接種后不同時(shí)間加入相同濃度S2-的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得到，不同時(shí)間加入對(duì)酒精發(fā)酵的抑制作用不同，接種后越早加入硫化物其抑制作用越大。說(shuō)明H2S主要影響了發(fā)酵前期酵母的生長(zhǎng)繁殖過(guò)程，加入時(shí)間越晚，酵母生長(zhǎng)發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)生越多的CO2將H2S吹脫帶出發(fā)酵體系，減少了對(duì)酒精發(fā)酵的抑制。

[1]Biatas W，Szymanowska D，Grajek W.Fuel ethanol production from granular corn starch using Saccharomyces cerevisiae in a long term repeated SSF process with full stillage recycling[J］.Bioresource Technology，2010，101:3126-3131.

[2]趙江，趙華.酒糟濾液全回用技術(shù)在酒精發(fā)酵上的應(yīng)用[J］.食品研究與開(kāi)發(fā)，2008，29(6):75-78.

[3]Ding Zhong-yang，Zhang Liang，F(xiàn)ang Ya-ye，et al.Application of full permeate recycling to very high gravity ethanol fermentation from corn[J］.Korean Journal of Chemical Engeering，2009，26(3):719-723.

[4]方亞葉，石貴陽(yáng).酒精廢糟液的綜合處理[J］.釀酒，2003，30(1):74-77.

[5]毛忠貴，張建華.酒精制造的“零能耗零污染”趨勢(shì)[J］.生物工程學(xué)報(bào)，2008，24(6):946-949.

[6]張成明，翟芳芳，張建華，等.木薯酒精生產(chǎn)中厭氧消化液的回用工藝研究[J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36(17):7417-7240.

[7]Zhang Cheng Ming，Mao Zhong-gui，Wang Xin，et al .Effective ethanol production by reutilizing waste distillage anaerobic digestion effluent in an integrated fermentation process coupled with both ethanol and methane fermentations[J］.Bioprocess Biosystem Engineering，2010，33(9):1067-1075.

[8]張靜，翟芳芳，張建華，等.酒精沼氣雙發(fā)酵偶聯(lián)中厭氧沼氣的發(fā)酵行為[J］.食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2010，29(2):276-281.

[9］ 賀延齡.廢水的厭氧生物處理[M］.北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社，1998:273-285.

[10]任南琪，王愛(ài)杰，馬放.產(chǎn)酸發(fā)酵微生物生理生態(tài)學(xué)[M］.北京:科學(xué)出版社，2005:302-304.

[11］ 倪靜安，商少明，翟濱，等.無(wú)機(jī)及分析化學(xué)[M］.第二版.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:50-54.

[12]姜立，張成明，張宏建，等，“酒精沼氣雙發(fā)酵耦聯(lián)”工藝的探討——硫化物對(duì)木薯酒精發(fā)酵的影響[J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2011，37(10):6-10.

[13]Maurizio Ugliano，Radka Kolouchova，Paul A Henschke，et al.Occurrence of hydrogen sulfide in wine and in fermentation:influence of yeast strain and supplementation of yeast available nitrogen[J］.Journal of Industry Microbiology Biotechnology，2011，38:423-429.

ABSTRACTEthanol fermentation could be inhibited by sulfide，which is harmful to the process of ethanol methane coupled fermentations.Compared to the control，at pH 4.0 and with 24 mmol/L sulfide existed，ethanol fermentation time was prolonged from 48 to 318 h，ethanol concentration was decreased from 90.73 to 82.28 g/L，yeast cell number was declined from 3.78×108to 2.20×108cell/mL，and glycerol concentration was increased from 6.99 to 11.02 g/L.Increased glycerol production could contribute to the decreased ethanol production when sulfide existed.Inhibition of sulfide to ethanol fermentation was weakened as delay of addition，because sulfide could escape from the fermentation broth with CO2as the form of H2S.At pH 4.0，critical inhibition concentration of sulfide to ethanol fermentation was 1.2 mmol/L.cassava，fuel ethanol，sulfate，sulfide，critical inhibition concentration

Key wordscassava，fuel ethanol，sulfate，sulfide，critical inhibition concentration

Effect of Sulfide on Ethanol Fermentation in the"Ethanol Methane Coupled Fermentations"Process

Liu Hui-hui1，2，Jiang Li1，2，Zhang Cheng-ming1，2，Zhang Jian-hua1，2，Mao Zhong-gui1，2
1(The Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)
2(School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

碩士研究生(毛忠貴教授為通訊作者)。

*國(guó)家863計(jì)劃項(xiàng)目(2008AA10Z338);江蘇省科技支撐計(jì)劃(SBE201171007)

2012-02-07，改回日期:2012-04-09