黃芳，周宏，陳華，扶慶權(quán)

1(南京曉莊學(xué)院 生物化工與環(huán)境工程學(xué)院，江蘇 南京，211171)

2(重慶大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，重慶，400030)

橘皮中橙皮苷提取的優(yōu)化及其對(duì)羥自由基清除作用*

黃芳1，周宏1，陳華2，扶慶權(quán)1

1(南京曉莊學(xué)院 生物化工與環(huán)境工程學(xué)院，江蘇 南京，211171)

2(重慶大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，重慶，400030)

通過(guò)單因素試驗(yàn)分析了乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取溫度和提取時(shí)間對(duì)橙皮苷得率的影響，在此基礎(chǔ)上選擇4因素3水平的Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用響應(yīng)面法對(duì)橘皮中橙皮苷的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明:最佳提取工藝條件為溶劑中乙醇體積分?jǐn)?shù)71﹪，液料比22∶1 mL/g，提取溫度70℃，提取時(shí)間2.5 h。經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，在此條件下，得率達(dá)4.82%。對(duì)橙皮苷提取液的抗氧化研究表明，橙皮苷對(duì)羥自由基有一定的清除作用。

響應(yīng)曲面，橙皮苷，提取工藝，羥自由基

橙皮苷是一種廣泛存在于柑橘類水果中的類黃酮物質(zhì)，尤其是在柑、橘、橙和檸檬等的果皮中含量較高。藥理研究表明，橙皮苷具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、降血脂、維持血管正常滲透壓、增強(qiáng)毛細(xì)血管韌性、保護(hù)心血管等多種功效，在臨床上用于心血管系統(tǒng)疾病的輔助治療，也用于醫(yī)藥工業(yè)中制藥的原料[1］。此外，橙皮苷可在食品工業(yè)中可用作天然抗氧化劑，也可用于化妝品行業(yè)，其逐漸成為食品添加劑、日用化工業(yè)關(guān)注的熱點(diǎn)。

橙皮苷常用的提取方法有熱水提取法、溶劑提取法[2］、堿提酸析法[3］、超聲波提取法[4］、微波提取法[5］和酶解法[6］等。其中，熱水提取法、溶劑提取法和酸提堿析法簡(jiǎn)單易操作，是傳統(tǒng)的提取方法。傳統(tǒng)的橙皮苷提取工藝各有優(yōu)缺點(diǎn):如熱水提取法工藝簡(jiǎn)單，但產(chǎn)物雜質(zhì)多，收率低。堿浸酸析法需大量使用酸堿，會(huì)產(chǎn)生鹵鹽等副產(chǎn)物。醇溶劑提取得到橙皮苷的純度較高，有機(jī)溶劑可以回收，且不使用大量的酸或堿，有利于環(huán)境保護(hù)。有文獻(xiàn)報(bào)道[3］，用甲醇提取橙皮苷效率較高，但甲醇毒性較大，只適合實(shí)驗(yàn)室使用，而乙醇毒性小、使用安全，不僅實(shí)驗(yàn)室可以使用，而且適合規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)。采用響應(yīng)面法優(yōu)化乙醇提取橙皮苷的提取工藝尚未見報(bào)道。本研究在乙醇提取法單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化橘皮中橙皮苷的提取工藝，并評(píng)價(jià)優(yōu)化條件下提取物對(duì)羥自由基的清除作用，以其為橙皮苷的工業(yè)化生產(chǎn)和進(jìn)一步開發(fā)利用提供科學(xué)參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

722N型分光光度計(jì)，上海第三分析儀器廠;AUY120電子天平，日本島津;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司;101A-2型電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司。

橘皮(市售)于40℃烘箱中烘干，粉碎，過(guò)60目篩，裝瓶備用。

甲醇:99.5%;雙氧水30%:;硝酸鋁99%;硫酸亞鐵溶液(3.0 mmol/L);水楊酸-乙醇溶液(3.0 mmol/L);無(wú)水乙醇。橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品:購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所。以上試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，甲醇充分溶解并定容于50mL容量瓶中，得到橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別準(zhǔn)確吸取橙皮苷儲(chǔ)備液 0.50、1.00、1.50、2.00、2.05、3.00、3.50、4.00 mL 置于 10 mL 容量瓶中，加入1.00 mL 5%的Al(NO3)3溶液，于80℃水浴中加熱15 min后，冷卻后定容至刻度。橙皮苷與 Al(NO3)3能形成黃色絡(luò)合物，其最大吸收波長(zhǎng)為390 nm，見圖1。以試劑作空白，依次測(cè)定各溶液的吸光度，可得吸光度A與橙皮苷濃度c(μg/mL)的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為:A=0.003c+0.008，相關(guān)系數(shù) R2=0.9990，見圖2。試驗(yàn)表明，橙皮苷在5～40 μg/mL的濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

圖1 橙皮苷-Al絡(luò)合物的吸收曲線

圖2 橙皮苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.2 供試品溶液的制備和測(cè)定

準(zhǔn)確稱取5 g橘皮粉末，加入一定濃度的乙醇，回流提取。過(guò)濾后冷卻，置250 mL容量瓶中定容至刻度，搖勻得提取液。精密移取一定體積提取液，置于10 mL容量瓶中，加入1.00 mL 5%的Al(NO3)3溶液，于80℃水浴中加熱15 min后，冷卻后定容至刻度，待測(cè)。由于橙皮苷樣品未經(jīng)脫色，本身含有雜質(zhì)黃，在測(cè)定時(shí)設(shè)置試劑空白做對(duì)照，用總的吸光度值減去非黃酮類物質(zhì)在390 nm下的吸光度值[7］。根據(jù)所得吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算橙皮苷的含量及得率:

1.2.3 單因素試驗(yàn)

為確定橙皮苷的提取工藝，取定量橘皮，研究乙醇體積分?jǐn)?shù)(50%～100%)、液料比(5∶1～30∶1 mL/g)、提取溫度(40～90℃)及提取時(shí)間(1～3.5 h)4個(gè)因素對(duì)橙皮苷得率的影響，以確定優(yōu)化設(shè)計(jì)參數(shù)范圍。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，以乙醇體積分?jǐn)?shù)(X1)、液料比(X2)，提取溫度(X3)、提取時(shí)間(X4)為考察因素，以橙皮苷的得率為響應(yīng)值，采用4因素3水平的Box-Behnken Design(BBD)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化提取條件。

1.2.5 橙皮苷清除羥自由基的研究

參照文獻(xiàn)[8］采用Fenton反應(yīng)體系產(chǎn)生羥自由基模型。在反應(yīng)體系中，H2O2與Fe2+混合反應(yīng)產(chǎn)生·OH，但由于·OH具有很高的反應(yīng)活性，存活時(shí)間短，若在反應(yīng)體系中加入水楊酸，就能有效的捕捉·OH，并產(chǎn)生有色物質(zhì)，該產(chǎn)物在510 nm處有強(qiáng)吸收。若在此反應(yīng)體系中加入有清除·OH功能的被測(cè)物，便會(huì)與水楊酸競(jìng)爭(zhēng)，從而使有色產(chǎn)物的生成量減少。

清除率/%=[A0-(AX-AX0)］/A0×100

式中:A0為空白對(duì)照液的吸光度;AX為加入被測(cè)物后的吸光度;AX0為不加H2O2的吸光度。

方法:在25 mL比色管中依次加入3.0 mmol/L FeSO4溶液2mL，3.0 mmol/L水楊酸-乙醇溶液2mL，2.5 mmol/L H2O22 mL，搖勻，蒸餾水定容至刻度，于37℃水浴中反應(yīng)30 min，于510 nm處測(cè)定吸光度A0，在上述體系中不加H2O2的溶液測(cè)定得到AX0，分別加入不同體積的橙皮苷提取液測(cè)定吸光度為AX，所有溶液均以蒸餾水為參比。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響

由圖3所示，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增大橙皮苷得率會(huì)逐漸增加，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)得率最高，為4.79%。再繼續(xù)增加乙醇體積分?jǐn)?shù)時(shí)橙皮苷得率反而會(huì)降低，其原因可能是乙醇體積分?jǐn)?shù)高，溶液所含的水分減少，不能充分浸入到橘皮里，導(dǎo)致得率下降[9］。因此選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%作后續(xù)試驗(yàn)繼續(xù)考察。

圖3 乙醇濃度對(duì)得率的影響

2.1.2 不同液料比的影響

由圖4可知，在液料比達(dá)到20∶1 mL/g前，橙皮苷得率隨著提取液用量的增加而增加。料液比為20∶1 mL/g時(shí)，得率最大達(dá)4.73%。但再增加液料比，得率反而下降，這是因?yàn)槿軇┯昧窟_(dá)到一定程度時(shí)橘皮中橙皮苷已基本全部溶出，再增加溶劑的用量不僅增加成本，還會(huì)給后續(xù)的處理增加困難。因此選擇液料比為20∶1 mL/g。

圖4 液料比對(duì)得率的影響

2.1.3 提取溫度的影響

溫度越高，分子運(yùn)動(dòng)加速，溶劑提取效率越高。由圖5可知，隨著提取溫度的增加，橙皮苷溶解度增大，得率增加，70℃時(shí)得率達(dá)4.77%。但溫度高于70℃后得率呈下降趨勢(shì)?？赡苁怯捎跍囟雀叨鴮?dǎo)致其它組分的溶解從而抑制了橙皮苷的溶出，同時(shí)高溫也可能導(dǎo)致橙皮苷的結(jié)構(gòu)被破壞。因此，試驗(yàn)選擇為70℃為最佳的提取溫度。

圖5 提取溫度對(duì)得率的影響

2.1.4 提取時(shí)間的影響

如圖6所示，得率隨著提取時(shí)間的增加而增加。當(dāng)提取時(shí)間為2.5 h時(shí)，得率達(dá)4.62%。但提取時(shí)間超過(guò)2.5 h后，得率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。提取時(shí)間較短時(shí)，橙皮苷來(lái)不及溶出，時(shí)間太長(zhǎng)則可能會(huì)因?yàn)槌绕ぼ找蜷L(zhǎng)時(shí)間受熱使結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，且隨著提取時(shí)間的增加干擾成分的溶出量也隨之增加，導(dǎo)致提取量下降。故試驗(yàn)選擇提取提取時(shí)間為2.5 h。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 橙皮苷提取工藝回歸模型的建立及方差分析

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，進(jìn)行4因素3水平的Box-Behnken Design(BBD)試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化提取條件，試驗(yàn)因素水平及編碼見表1。自變量的編碼值1、0、-1分別代表自變量的高、中、低水平。選取了4因素3水平共29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)(5個(gè)中心點(diǎn))的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)表格及試驗(yàn)結(jié)果見表2，回歸模型的方差分析見表3。

圖6 提取時(shí)間對(duì)得率的影響

表1 響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素水平和編碼

表2 響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 回歸模型的方差分析

對(duì)表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到橙皮苷的得率對(duì)以上4個(gè)因素的二次多項(xiàng)回歸模型為:

式中:Y為橘皮中橙皮苷的得率的預(yù)測(cè)值;X1、X2、X3、X4分別代表乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取溫度、提取時(shí)間的編碼值。表3方差結(jié)果顯示，方程復(fù)相關(guān)系數(shù)的平方R2為0.9830，說(shuō)明該模型極顯著(P＜0.01);為0.9661，說(shuō)明建立的模型能夠解釋96.61%響應(yīng)值的變化，能很好地描述橘皮中橙皮苷提取過(guò)程的得率隨提取條件的變化規(guī)律。因此，該方程擬合情況合理可靠。從回歸方程各項(xiàng)方差檢驗(yàn)可以看出，方程的二次項(xiàng)的影響均極顯著，交互影響顯著，各一次項(xiàng)顯著性參差不齊，表明各影響因素對(duì)橙皮苷得率的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，所以可以利用回歸方程來(lái)確定最佳提取工藝條件。

圖7 乙醇濃度(X1)、液料比(X2)、提取時(shí)間(X3)和提取溫度(X4)對(duì)橙皮苷得率影響的響應(yīng)面圖

2.2.2 響應(yīng)曲面分析與優(yōu)化

各因素及其交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響結(jié)果可通過(guò)響應(yīng)面分析圖形象地看出來(lái)。特征值均為正值時(shí)，響應(yīng)面分析圖為山谷形曲面，有極小值存在;當(dāng)特征值為負(fù)值時(shí)，為山丘曲面，有極大值存在;當(dāng)特征值有正有負(fù)時(shí)，為馬鞍形曲面，無(wú)極值存在[10］。從圖7各因素間的響應(yīng)曲面圖可以看出，各圖均為山丘曲面，即得率Y隨著任意2個(gè)編碼值的增加呈先升高后降低的趨勢(shì)，說(shuō)明各交互因子均有一個(gè)最佳編碼組合使得率Y達(dá)到最高。

為了進(jìn)一步確證最佳點(diǎn)的取值，對(duì)回歸方程取一階偏導(dǎo)數(shù)并令其等于零，可以得到曲面的最大點(diǎn)，即4個(gè)主要因素的最佳水平值，轉(zhuǎn)換整理得到橙皮苷提取的最佳條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)70.7%，液料比為21.35 mL/g，提取溫度為69.4℃，提取時(shí)間為2.48 h，在此條件下橙皮苷得率理論值可達(dá)4.86%。為檢驗(yàn)響應(yīng)面法所得結(jié)果的可靠性，采用上述優(yōu)化提取條件進(jìn)行橙皮苷的提取，考慮到實(shí)際操作的便利，將提取工藝參數(shù)修正為乙醇體積分?jǐn)?shù)71.0%，液料比為22∶1 mL/g，提取溫度為70℃，提取時(shí)間為2.5 h，實(shí)際測(cè)得橘皮中橙皮苷的得率為4.82%，與理論預(yù)測(cè)值比較相對(duì)誤差為0.82%，說(shuō)明該模型可以較好地預(yù)測(cè)橘皮中橙皮苷的提取條件與橘皮中橙皮苷的得率之間的關(guān)系，具有一定的實(shí)用價(jià)值。

2.3 橘皮中橙皮苷清除羥自由基的研究

不同濃度的橙皮苷提取液對(duì)·OH的清除結(jié)果見圖8。試驗(yàn)表明，橙皮苷提取液對(duì)·OH有明顯的清除作用。隨著橙皮苷濃度的增加，對(duì)·OH的清除能力也逐漸增強(qiáng)，且二者間具有較好的相關(guān)性，回歸方程Y=6.13X-11.801(R2=0.9778)。橙皮苷提取液對(duì)·OH的半清除率IC50=10.08 μg·mL，表明橙皮苷具有較強(qiáng)的抗氧化能力。

圖8 橙皮苷提取液對(duì)羥自由基的清除率

3 結(jié)論

本文應(yīng)用試驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件Design-Expert7.0，采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)中的Box-Behnken設(shè)計(jì)，利用模型的響應(yīng)面及等高線對(duì)橘皮中橙皮苷提取工藝中的4個(gè)提取條件的相互作用進(jìn)行了探討，確定了最佳水平范圍，優(yōu)化出最優(yōu)工藝條件為:以體積分?jǐn)?shù)為71%的乙醇為提取溶劑，液料比22∶1 mL/g，在70℃下反應(yīng)2.5 h，在此條件下橙皮苷的得率達(dá)4.82%。此外，橙皮苷提取液對(duì)羥自由基的清除作用說(shuō)明，橙皮苷具有良好的抗氧化能力。

[1]方修貴，戚行江，胡安生.柑橘果實(shí)中抗癌活性物質(zhì)的研究現(xiàn)狀和前景[J〗.食品與發(fā)酵工業(yè)，2003，29(10):79-82.

[2]周建國(guó)，邵青，陳柳榕.陳皮提取工藝的優(yōu)化選擇[J］.中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志，1998，15(2):17-18.

[3]梁開玉，羅啟波，喻梅.從陳皮中提取橙皮苷工藝研究[J］.重慶工商大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2004，21(1):19-22.

[4]耿敬章，錢英，張志健，等.超聲波輔助提取橘皮中橙皮苷[J］.中國(guó)食品添加劑，2009，12(7):63-68.

[5]孫秀利，張力，秦培勇，等.微波法提取陳皮中橙皮苷[J］.中藥材，2007，30(6):712-714.

[6]曾柏全，周小芹，解西玉.纖維素酶-微波法提取臍橙皮橙皮苷工藝優(yōu)化[J］.食品科學(xué)，2010，34(4):85-89.

[7]陳建秋，胡志軍，王南溪，等.枳實(shí)皮中橙皮苷的提取測(cè)定及對(duì)自由基清除作用的研究[J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2009，20(10):2394-2397.

[8]李貴榮，楊勝圓.黨參多糖的提取及其對(duì)活性氧自由基的清除作用[J］.化學(xué)世界，2001，42(3):421-422.

[9]陳曉偉，陳榮燕，韋媛媛等.堿提酸沉法提取枳實(shí)中橙皮苷的工藝優(yōu)化[J］.糧油加工，2010，4:109-112.

[10]Manoharcs G.An improved response surface method for the determination of failure probability and importance measures[J］.Structural Safety，2004，26:123-139.

ABSTRACTFour factors including ethanol concentration，solvent to material ratio，extraction temperature and extraction time were studies on the yield of hesperidin from the citrus peel by using single factor analysis method.Then a four factor，three-level Box-Behnken central composite design(CCD)coupled with response surface analysis(RSM)was applied in optimization of the extraction.It was found that the optimum extraction conditions were:ethanol concentration 71%，solvent to material ratio 22∶1(mL/g)，extraction temperature 70℃ and extraction time 2.5 h.Under the optimized extraction conditions，hesperidin extraction yield was 4.82%.The research on anti-oxidation properties showed that the extracted hesperidin had scavenging activity on free hydroxyl radical.

Key wordsresponse surface methodology，hesperidin，extraction technological conditions，hydroxyl free radical

Optimization of Total Hesperidin Extraction from Citrus Peel by Response Surface Methodology and Its Scavenging Activity on Free Hydroxyl Radial

Huang Fang1，Zhou Hong，Chen Hua2，F(xiàn)u Qing-quan1
1(College of Biochemical Engineering and Environmental Engineering，Nanjin XiaoZhuang University，Nanjing 211171，China)
2(College of Chemistry and Chemical Engineering，Chongqing University，Chongqing 400030，China)

碩士研究生，講師。

*國(guó)家自然科學(xué)基金(21171097);重慶市自然科學(xué)基金(2010BB0063)資助

2011-10-08，改回日期:2012-03-09