王步江，姜丹，涂然

1(天津農(nóng)學院食品科學系，天津，300384)

2(天津大學化工學院，天津，300072)

3(中國科學院天津工業(yè)生物技術研究所，天津，300308)

嗜熱堿性果膠酶產(chǎn)生菌的篩選及產(chǎn)酶條件優(yōu)化*

王步江1，姜丹2，涂然3

1(天津農(nóng)學院食品科學系，天津，300384)

2(天津大學化工學院，天津，300072)

3(中國科學院天津工業(yè)生物技術研究所，天津，300308)

從極端土壤中分離到1株高效產(chǎn)堿性果膠酶菌株RH214，經(jīng)鑒定為Bacillus smithii。為了進一步提高其產(chǎn)果膠酶活性，對產(chǎn)酶的培養(yǎng)基成分進行了優(yōu)化。首先采用單因素試驗篩選出最佳碳源為可溶性淀粉，最佳氮源為蛋白胨，金屬鹽為KH2PO4。根據(jù)單因素結果確定可溶性淀粉濃度、蛋白胨濃度和KH2PO4濃度為主因素，利用Box-Behnken試驗設計和響應面法分析確定各因素的最優(yōu)水平，得出菌株RH214的最優(yōu)產(chǎn)酶條件:可溶性淀粉的濃度為85.6 g/L、蛋白胨濃度11.8 g/L、KH2PO4濃度為3.8 g/L、酵母粉1 g/L、FeSO41g/L、KCl 0.5 g/L、起始pH9.0、裝液量80 mL/250 mL、溫度40℃、搖床轉(zhuǎn)速150 r/min，培養(yǎng)時間為16 h。在此條件下，進行驗證實驗，獲得產(chǎn)酶活性為(88±0.86)U/mL，比未優(yōu)化前的20.50 U/mL提高了4.3倍。

堿性果膠酶，Plackett-Burman設計，響應面，培養(yǎng)基

果膠酶是一類含有多種組分的可將果膠分解成半乳糖醛酸等物質(zhì)的生物催化劑，是分解果膠質(zhì)的多種復合酶類的統(tǒng)稱[1］，通常包括聚半乳糖醛酸酶(PG)、果膠酯酶(PE)、果膠裂解酶(PL)等主要組分。微生物因具有生長速度快、生長條件簡單、代謝過程特殊和分布廣等特點而成為實際生產(chǎn)中果膠酶的主要來源。果膠酶在生產(chǎn)上的應用已有50余年的歷史，已被廣泛應用于果汁、果酒的澄清，水果蔬菜的液化、浸解，濃縮咖啡和速溶茶的加工以及木材防腐，棉織物精煉加工等方面[2-3］。堿性果膠酶是非常重要的工業(yè)酶制劑之一，具有不可估量的潛在應用價值，其在棉麻織品生產(chǎn)工藝及某些蔬菜處理工藝中顯示其獨到的優(yōu)勢堿性果膠酶的研究可擴展果膠酶的應用范圍[3］。目前國內(nèi)果膠酶發(fā)酵的酶活力低，導致生產(chǎn)成本高，限制了該酶的廣泛應用，本文針對從極端環(huán)境中分離出產(chǎn)果膠酶的地衣芽孢桿菌，并對產(chǎn)堿性果膠酶的培養(yǎng)基條件進行了優(yōu)化，為進一步規(guī)模生產(chǎn)、分離純化及應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土樣

土樣采自云南騰沖溫泉附近，采樣點溫度50～80℃，pH 7～10。

1.1.2 主要試劑及儀器

主要試劑:3，5-二硝基水楊酸、果膠，半乳糖醛酸，蛋白胨、KH2PO4、葡萄糖、麥芽糖、可溶性淀粉等。

主要儀器:FA604A電子分析天平，上海精天電子儀器有限公司;DX-35BI電熱壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠;SW-CJ-2FD雙人單面凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司;KYC-100C全溫振蕩器，上海?，攲嶒炘O備有限公司;752型可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司;TGL-16B臺式離心機，上海安亭科學儀器廠

1.1.3 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基:果膠10 g、KH2PO42 g、(NH4)2SO45g、FeSO41 g、KCl5g、CaCl22 g、MgSO43 g;水1000mL，培養(yǎng) pH 9。

初篩培養(yǎng)基:果膠10 g、酵母粉1g、KH2PO42 g、(NH4)2SO45 g、FeSO41g、KCl5g、CaCl22 g、MgSO43 g、水1000mL，培養(yǎng) pH 9。

產(chǎn)酶基礎培養(yǎng)基:葡萄糖10 g、酵母粉1 g、FeSO41g 、KCl5g、水1000 mL，培養(yǎng) pH 9。

1.2 方法

1.2.1 菌種篩選

10 g土壤置于40 mL生理鹽水中，加玻璃珠打散。移取10～40 mL富集培養(yǎng)基，50℃培養(yǎng)2～3 d。富集培養(yǎng)液梯度稀釋后，涂布到以果膠為唯一碳源的初篩平板上，50℃培養(yǎng)2～3 d。從初篩平板上挑取較大的菌落，劃線分離后接種到平板中過夜培養(yǎng)，種子液接入產(chǎn)酶基礎培養(yǎng)基中，40℃振蕩培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速150 r/min，裝液量80 mL，16 h 后取樣測酶活力[7］。

1.2.2 果膠酶活性測定

取一定稀釋倍數(shù)的發(fā)酵液4000 r/min，0.5 mL于具塞試管中(以滅酶發(fā)酵液作為空白對照)加入2.0 mL4g/L標準果膠溶液(pH 10.0)，于50℃恒溫水浴中反應30 min，按DNS法測定還原糖，752分光光度計530 nm處比色。半乳糖醛酸標準曲線參照文獻[5］進行。酶活定義:在本實驗條件下，以每分鐘由底物產(chǎn)生1 μg半乳糖醛酸所需的酶量為1個酶活力單位(1 U=1 μg/min)。

1.2.3 菌種的鑒定

根據(jù)《伯杰細菌鑒定手冊》，對篩選的菌體進行表型和生理生化實驗鑒定。另外以嗜熱菌的總基因組為模板，進行16S rDNA系列擴增。根據(jù)細菌16S rDNA保守序列設計的通用引物，引物序列為:16S-F:5’-AGAGTTTGATCCTGGC TCA G-3’和 16 S-R:5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。通過 PCR擴增其16S rDNA編碼基因。將擴增片段回收后測序，序列在 NCBI上檢索比對[7］。

2 結果與分析

2.1 產(chǎn)堿性果膠酶菌株的篩選

通過多輪初篩和復篩，得到30株產(chǎn)果膠酶的細菌，接種到基礎產(chǎn)酶培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每隔6h測其酶活力，在培養(yǎng)至16 h時，其中的1株產(chǎn)酶量最高，酶活力可達到20.50 U/mL。命名為RH214。該菌落圓形，扁平，邊緣整齊，白色粗糙，不透明，有淡淡的異味。通過生理生化特性及16S DNA序列分析，確定RH214 為 Bacillus smithii。

本實驗對RH214果膠酶酶粗酶液作了初步的酶學性質(zhì)研究，發(fā)現(xiàn)它在50℃時酶活性最高，70℃時酶活性也能達到最高值的80%，最適pH值為9.0。由此確定該菌產(chǎn)的堿性果膠酶是一種具有優(yōu)良特性的果膠酶，以下實驗通過優(yōu)化培養(yǎng)基來提高其果膠酶的產(chǎn)量。

2.2 碳源

碳源在微生物生長和產(chǎn)酶過程中有重要的作用，為微生物的正常生長，分裂提供物質(zhì)基礎。地衣芽孢桿菌可利用多種碳源進行生長，考慮到果膠酶是誘導性酶類，培養(yǎng)基碳源采用含有果膠或一些可溶性糖類可能更有利于果膠酶的積累，將菌接種于含酵母粉1 g/L，添加100 g/L不同碳源的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)16 h，測其酶活力。其結果見圖1。

圖1 不同種類的碳源對酶活力的影響

由圖1可知，在碳源中大分子的糖類比單糖有利于酶活力的提高，可溶性淀粉最有利于果膠酶的產(chǎn)生，其酶活性最高，可達到65.46 U/mL?？赡茉蚴强扇苄缘矸郾旧砭褪谴蠓肿游镔|(zhì)具有類似果膠的性質(zhì)，可以起到誘導果膠酶的產(chǎn)生和積累。由此確定RH214菌株產(chǎn)果膠酶的最適碳源為可溶性淀粉，酶活性依次為麥芽糖、果糖、蔗糖、葡萄糖，木糖。

2.3 氮源

微生物的細胞由蛋白質(zhì)、核酸、脂類和水組成，果膠酶本身又是蛋白質(zhì)，而氮素則是組成蛋白質(zhì)和核酸的主要元素。在酶制劑工業(yè)中，氮源是不可缺少的重要原料。向基礎培養(yǎng)基中分別加入不同的有機和無機氮源進行試驗。黃豆粉、玉米粉添加量為10 g/L，酵母粉、蛋白胨、硫酸銨、硝酸銨添加量為5 g/L。

圖2 不同種類的氮源對酶活力的影響

由圖2可知，黃豆粉、玉米粉等粗放氮源對產(chǎn)酶的作用也較好，但有機氮源產(chǎn)酶比無機氮源要好，在基本培養(yǎng)基中添加蛋白胨可迅速提高酶活力，對果膠酶活力影響最大，主要是蛋白胨營養(yǎng)豐富，所以在后續(xù)的實驗中采用蛋白胨作為培養(yǎng)基的氮源。大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)時考慮經(jīng)濟效益因素，可采用粗放氮源和無機氮源，這樣產(chǎn)品成本較低，更有競爭力。

2.4 不同金屬鹽

無機鹽是微生物生長必不可少的一類營養(yǎng)物質(zhì)，微生物在生長繁殖和代謝過程中，都需要無機鹽離子，它們在機體中的生理功能主要是作為酶的活性中心的組成部分，維持生物大分子和細胞結構的穩(wěn)定性、調(diào)節(jié)并維持細胞的滲透壓平衡、控制細胞的氧化還原電位和作為某些微生物生長的能源物質(zhì)等?；A培養(yǎng)基中分別添加2 g/L的 NaCl、CaCl2、MgSO4、KH2PO4和FeSO4來確定不同無機鹽離子對產(chǎn)酶的影響，如圖3所示。與對照比較可發(fā)現(xiàn)，KH2PO4有利于果膠酶的產(chǎn)生和積累，F(xiàn)eSO4次之，NaCl、CaCl2、MgSO4對酶的作用不明顯。

圖3 不同種類的金屬離子對酶活力的影響

2.5 Box-Behnken試驗設計及結果

培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)的配比合適時，微生物才能產(chǎn)生較高的酶活性，而各個成分之間都存在著一定的交互作用，從單因素的結果發(fā)現(xiàn)可溶性淀粉、蛋白胨和KH2PO4對酶活力的提高作用明顯。為了確定最優(yōu)水平，利用響應面法對產(chǎn)酶活力的主效因子進一步優(yōu)化。以酶活力為響應值，Design-Expert version 7.1.6 trial進行Box-Behnken試驗設計來探究三者間的關系[8］。設計方案及結果見表1、表2。

表1 Box-Behnken試驗因素水平表

表2 Box-Behnken試驗設計及結果

續(xù)表2

利用Design Expert 7.1.6 trial軟件對表2的數(shù)據(jù)進行二次多項回歸擬合，獲得產(chǎn)酶活力對可溶性淀粉、蛋白胨、KH2PO4的二次多項回歸方程:

表3 二次多項式模型方差分析

由表3可知，F(xiàn)值為31.66，復相關系數(shù) R2=0.9760，表明97.6%的酶活力的變化可以有此模型解釋，說明模型對實際情況擬合較好;模型的P值為0.0055說明該模型顯著，可用來進行響應面預測。校正系數(shù)表明R2Adj=0.9452，表明94.52%試驗數(shù)據(jù)的變異性可用此回歸模型來解釋。

表4 二次多項回歸方程系數(shù)的顯著性檢驗

表4可知，蛋白胨和KH2PO4對菌株產(chǎn)堿性果膠酶活力的線性效應顯著，但可溶性淀粉濃度線性效應不顯著;相比較而言，各因素的平方項效應極為極顯著;各因素之間的交互作用顯著。

2.6 響應面優(yōu)化結果的分析

由二次回歸方程所得到的響應面圖及相應的等高線見圖4～圖6。各因素交互作用對響應值酶活力的影響由圖可直觀地反映出來。

圖4 可溶性淀粉濃度和蛋白胨質(zhì)量濃度對酶活力影響的響應面和等高線

由圖4可看出，可溶性淀粉濃度和蛋白胨濃度交互作用顯著，可溶性淀粉濃度變化對酶活力的影響沒有蛋白胨明顯。隨著蛋白胨濃度的逐漸增加，堿性果膠酶活力也逐步增加?？扇苄缘矸劭勺鳛榧毦囊环N較好的廉價碳源。

圖5 可溶性淀粉濃度和KH2PO4濃度對酶活力影響的響應面和等高線

由圖5可看出，可溶性淀粉和KH2PO4的濃度交互作用顯著，隨著KH2PO4濃度的降低，菌株產(chǎn)酶活力逐漸增大，可溶性淀粉濃度過高或者過低都會影響菌株產(chǎn)果膠酶的活力。KH2PO4濃度過高會抑制菌體的生長，不利于果膠酶的積累。

由圖6可看出，蛋白胨和KH2PO4的濃度交互作用顯著。隨著KH2PO4的濃度降低和蛋白胨濃度的增高，菌株產(chǎn)果膠酶活性逐步增加。蛋白胨濃度繼續(xù)升高時有利于果膠酶的積累。

圖6 KH2PO4濃度和蛋白胨濃度對酶活力影響的響應面和等高線

通過對回歸方程的進一步分析，確定Y的最大值為 88.19 U/mL，此時可溶性淀粉、蛋白胨和KH2PO43個因素的最優(yōu)編碼值為0.14，0.36，-0.1，實際對應的濃度為，85.6 g/L、11.8 g/L、3.8 g/L。為驗證模型的準確性，在此條件下進行了3組實驗，實測的果膠酶活力為(88±0.86)U/mL。這與模型預測值接近，說明該模型能較好地預測實際的產(chǎn)酶情況。

3 結論

本實驗從極端環(huán)境中篩選得到了1株高產(chǎn)果膠酶的菌株C1，經(jīng)鑒定為Bacillus smithii RH214，并對RH214菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的條件進行了優(yōu)化。首先確定最優(yōu)碳、氮源分別為可溶性淀粉和蛋白胨，金屬KH2PO4有利于堿性果膠酶的活性的提高。然后通過Box-Behnken試驗設計和響應曲面分析法對RH214菌株產(chǎn)酶活性有顯著影響的3個因素進行優(yōu)化組合，最終獲得最優(yōu)產(chǎn)酶條件為:可溶性淀粉的質(zhì)量為8.56 g/L、蛋白胨質(zhì)量濃度1.18 g/L、KH2PO4質(zhì)量濃度為0.38g/L、酵母粉1g/L、FeSO41 g/L、KCl5g/L、起始 pH9.0，裝液量 80 mL/250 mL，溫度40℃，搖床轉(zhuǎn)速150 r/min，培養(yǎng)時間為16h。在此條件下，進行驗證實驗獲得產(chǎn)酶活性為(88±0.86)U/mL，比未優(yōu)化前的20.50 U/mL提高了4.37倍。

[1]靳賀玲，秦姝.堿性果膠酶精煉對棉纖維表面結果的影響[J］.紡織學報，2009，30(3):59-63.

[2]Kashyap D R，Vohra P K，Chopra S，et al.Application of pectinase in the commercial sector:a review [J］.Bioresource Technology，2001，77(3):215-227.

[3]楊輝，陳合，石振海.果膠酶在蘋果酒生產(chǎn)中的應用[J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2003，29(12):110-112.

[4]張保國，白志輝，李祖明，等.克勞氏芽孢桿菌S-4菌株固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)堿性果膠酶[J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2005，31(3):8-11.

[5]朱宏莉，宋紀蓉，張嘉，等.果膠酶高產(chǎn)菌株的激光選育及發(fā)酵條件的優(yōu)化[J］.食品科學，2005，(12):160-163.

[6]Bai Z H，Zhang HX，Qi HY，et al.Pectinase production by Aspergillus niger using wastewater in solid state fermentation for eliciting plant disease resistance[J］.Bioresource Techhology，2004，95(1):49-52.

[7]張健紅，陳堅.一株堿性果膠酶高產(chǎn)細菌的分離、系統(tǒng)發(fā)育分析和產(chǎn)酶條件的初步優(yōu)化[J］.應用與環(huán)境生物學報，2005，11(3):254-358.

[8]林峰，蔡木易，谷瑞增，等.基于響應面的玉米分離蛋白酶解工藝研究[J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2008，34(1):60-64.

[9]Takao M，Nakaniwa T，Yoshikawa K，et al.Purification and characterization of thermostable pectate lyase with protopectinase activity from thermophilic Bacillus sp.TS 47[J］.Biosci Biotech Biochem，2000，64(11):2360-2367.

ABSTRACTA stain RH214 with high ability to produce pectinase was isolated from soil and identified as Bacillus smithii.In order to improve the production of pectinase，some fermentation conditions were optimized.According to single-factor experiments，the optimal carbon source ，nitrogen source and salt were determined to be soluble starch，peptone，and KH2PO4respectively.As the key factors，these single factors(soluble starch，peptone and KH2PO4)were further optimized by Box-Behnken design and response surface methodology.A maximum pectinase activity of(88 ±0.86)U/mL was obtained using the condition as follows:after 16 h fermentation of 80 mL fermentation medium containing soluble starch 85.6 g/L，peptone 11.8 g/100 mL，KH2PO43.8 g/L and FeSO41 g/L，KCl 0.5 g/L at an initial pH of 9.0，fermentation temperat.ure 40℃ with 150 r/min shaking.Under these conditions，the activity production was 4.3 times higher than the initial production(20.50 U/mL)before optimization.

Key wordspectinase，Plackett-Burman design，response surface methodology，fermentation optimization

Screening and Optimization of Bacillus smithii RH214 for Pectinase Activity

Wang Bu-jiang1，Jiang Dan2，Tu Ran3
1(Department of Food Science，Tianjin Agriculture College，Tianjin 300384，China)
2(School of Chemical Engineering and Technology，Tianjin University，Tianjin 300072，China)
3(Tianjin Institute of Industrial Biotechnology，Chinese Academy of Sciences，Tianjin 300308，China)

碩士，講師。

*天津市科學技術委員會工業(yè)生物專項“工業(yè)酶關鍵技術研究”(10ZCZDSY06900)

2012-01-10，改回日期:2012-03-02