李春穎 曲 嫻 張 笑

隨著我國(guó)進(jìn)入老齡化社會(huì)，血管性癡呆發(fā)病率仍在逐步上升，已成為嚴(yán)重威脅老年人生活質(zhì)量的疾病，給社會(huì)和家庭帶來(lái)了沉重的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)。目前，對(duì)VD的發(fā)病機(jī)制尚未完全探明［1，2］、臨床缺乏理想的治療措施［3］，如何改善血管性癡呆患者的臨床癥狀、明確發(fā)病機(jī)理，這些問(wèn)題一直被人們廣泛深入的研究。堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的一種，對(duì)神經(jīng)元的存活、生長(zhǎng)發(fā)育、分化、再生和功能維持具有不可替代的調(diào)節(jié)作用［4］。而堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子是否能改善血管性癡呆學(xué)習(xí)記憶功能障礙，以及堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子是如何改善其學(xué)習(xí)記憶功能障礙，目前尚未見(jiàn)報(bào)道。為此本課題采用清醒小鼠反復(fù)缺血再灌注制備VD動(dòng)物模型，用bFGF對(duì)VD動(dòng)物模型進(jìn)行干預(yù)，觀察其對(duì)模型小鼠的影響，揭示VD發(fā)病的部分機(jī)制，為bFGF防治VD的藥物作用靶位提供基本素材，為臨床實(shí)踐提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1.材料與方法

1.1 動(dòng)物與試劑 昆明種雄性小鼠80只，體重30.0±3.12g。由長(zhǎng)春高新區(qū)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，合格證號(hào):SCXK-(吉)2007-0008。bFGF注射液由Peprotech提供。

1.2 動(dòng)物模型制備及治療方法 將小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為4組:正常組、假手術(shù)組、模型組、bFGF組，每組各20只。模型組和bFGF組:分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，穿線，固定拉緊絲線阻斷血流10分鐘，松線使血液再灌注20分鐘，反復(fù)3次，建立血管性癡呆動(dòng)物模型。假手術(shù)組:只分離頸總動(dòng)脈，套絲線扣，但不阻斷血流。術(shù)后肌注青霉素0.2萬(wàn)單位/天，連續(xù)3天。正常組不作處理。bFGF組:建模后即刻腹腔注射bFGF(100μg/kg)，1次/天，連續(xù)7天。正常組、假手術(shù)組給予1ml生理鹽水腹腔注射，1次/天，連續(xù)注射7天。

1.3 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 建模后2周進(jìn)行Morris水迷宮測(cè)試。采用Morris水迷宮視頻跟蹤分析系統(tǒng)，在直徑80cm圓形水池中設(shè)置低于水面1cm透明站臺(tái)，水溫25±2℃，行為測(cè)試在安靜環(huán)境內(nèi)進(jìn)行6天，前5天進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)，將小鼠從東、南、西、北4個(gè)入水點(diǎn)背對(duì)站臺(tái)輕輕放入水池，同時(shí)記錄小鼠自入水到找到平臺(tái)所需時(shí)間即逃避到平臺(tái)上的潛伏期，每只小鼠重復(fù)4次，每次間隔30秒，以4次平均值作為當(dāng)日最終潛伏期時(shí)間進(jìn)入最后統(tǒng)計(jì)。如果小鼠在120秒內(nèi)未找到平臺(tái)，其潛伏期按120秒計(jì)算。第6天進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，將水迷宮中的平臺(tái)撤出，小鼠從平臺(tái)的對(duì)角線處放入，記錄小鼠在平臺(tái)所在象限的時(shí)間即穿越有效區(qū)的時(shí)間和120秒內(nèi)穿越平臺(tái)的次數(shù)。

1.4 冰盤(pán)上快速剖取腦組織 準(zhǔn)確稱量0.5g的右側(cè)大腦組織，按組織重量體積比為1:9加預(yù)冷的生理鹽水制成10%的組織勻漿，4℃ 3000rpm，離心10分鐘，取上清液，儲(chǔ)存-20℃冰箱備用，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定各樣品中蛋白質(zhì)含量，按試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定腦組織SOD、MDA含量。

2.結(jié)果

2.1 bFGF對(duì)擬VD小鼠Morris水迷宮的影響 與正常組比較，模型組小鼠尋找平臺(tái)的潛伏期顯著延長(zhǎng)(P＜0.01)，穿越有效區(qū)的時(shí)間明顯縮短，穿越平臺(tái)的次數(shù)減少(P＜0.01)。經(jīng)bFGF治療后，尋找平臺(tái)的潛伏期顯著縮短(P＜0.01，表1)，明顯延長(zhǎng)穿越有效區(qū)的時(shí)間(P＜0.01)，增加穿過(guò)平臺(tái)次數(shù)(P＜0.01，表2)。

表1 bFGF對(duì)擬VD小鼠尋找平臺(tái)潛伏期(，s)

表1 bFGF對(duì)擬VD小鼠尋找平臺(tái)潛伏期(，s)

注:與正常組比較，aP＜0.01;與模型組比較，bP＜0.01。

水迷宮測(cè)試第1天 第2天 第3天 第4天 第5天正常組 8 39.25±34.22 26.15±28.54 22.56±24.66 17.71±10.22 10.89±10.55假手術(shù)組 8 31.30±32.79 27.19±32.12 23.32±24.10 15.85±21.65 14.11±21.44模型組 9 62.12±45.33a 58.41±43.31a 46.36±40.88a 38.47±35.35a 36.94±32.38a bFGF組 8 33.27±26.68b 28.18±25.85b 25.28±27.52b 20.64±26.70b 15.37±13.29組別n b

表2 bFGF對(duì)擬VD小鼠空間探索實(shí)驗(yàn)的影響()

表2 bFGF對(duì)擬VD小鼠空間探索實(shí)驗(yàn)的影響()

注:與正常組比較，aP＜0.01;與模型組比較，bP＜0.01。

組別 動(dòng)物數(shù)(n)穿越有效區(qū)時(shí)間(s) 穿越平臺(tái)次數(shù)正常組 8 23.31±10.05 12.08±212假手術(shù)組 8 22.06±4.78 10.230±2.10模型組 9 12.01±2.50a 3.14±2.27a bFGF組 8 19.45±10.81b 8.75±2.43b

2.2 bFGF對(duì)血管性癡呆小鼠腦組織SOD活性、MDA含量的影響 與正常組比較，血管性癡呆小鼠腦組織SOD活性明顯下降(P＜0.01)，MDA含量明顯升高(P＜0.01)。而經(jīng)bFGF干預(yù)，小鼠腦組織SOD活性明顯升高(P＜0.01)，同時(shí)MDA含量降低(P＜0.01，表3)。

表3 bFGF對(duì)血管性癡呆小鼠腦組織SOD活力和MDA含量的影響(，n=10)

表3 bFGF對(duì)血管性癡呆小鼠腦組織SOD活力和MDA含量的影響(，n=10)

注:與正常組比較，aP＜0.01;與模型組比較，bP＜0.01。

組別 SOD(U/mg) MDA(nmol/mg)正常組 97.22±7.88 17.57±1.28假手術(shù)組 96.90±6.86 17.06±1.50模型組 44.80±4.95a 29.67±1.95a bFGF組 72.47±5.61b 22.34±1.24b

3.討論

反復(fù)性腦缺血是血管性癡呆的主要原因［5］。以往模擬血管性癡呆動(dòng)物模型，主要采用血管阻斷法，但其為單次腦缺血模型，且手術(shù)創(chuàng)傷較大、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡率高，造成的記憶缺損呈可逆性。其他動(dòng)物模型［6～9］也缺乏全面性和可靠性，都是從模擬人類(lèi)血管性癡呆發(fā)病的某一側(cè)面來(lái)完成的。本次實(shí)驗(yàn)采用清醒小鼠反復(fù)缺血再灌注，建立了血管性癡呆動(dòng)物模型。

血管性癡呆小鼠在Morris水迷宮中被動(dòng)回避反應(yīng)能力和空間分辨能力下降，學(xué)習(xí)記憶功能明顯受損。應(yīng)用bFGF治療后，小鼠穿越有效區(qū)時(shí)間以及穿越平臺(tái)次數(shù)明顯減少，表明bFGF對(duì)VD小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力有明顯改善作用。急性腦缺血和再灌注時(shí)，大量自由基產(chǎn)生同時(shí)伴有自由基清除酶功能降低，啟動(dòng)自由基連鎖反應(yīng)，加重腦缺血損傷［10］。本次實(shí)驗(yàn)顯示，血管性癡呆小鼠腦組織MDA含量顯著升高，SOD活力顯著下降，這與既往研究結(jié)果相一致［11］。bFGF有助于模型小鼠腦組織清除自由基，提高機(jī)體的抗氧化能力，減少缺血再灌注引起的細(xì)胞功能的損傷。

本次實(shí)驗(yàn)提示bFGF能夠改善血管性癡呆模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，提高機(jī)體抗氧化能力，減少自由基對(duì)腦神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，但其具體機(jī)制仍有待于進(jìn)一步的研究。

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