劉高梅 任海偉

(山西輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院輕工化工工程系1，太原 030013)

(蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院2，蘭州 730050)

蕓豆(Phaseolus vulgaris Linn.sp.)學(xué)名菜豆，是普通菜豆(如小黑蕓豆、小白蕓豆等)和多花菜豆(如圓奶華蕓豆 H、N、D、X等)的總稱(chēng)，屬豆科(Leguminosae)菜豆屬(Phaseolus L.)的小宗雜糧作物［1］。蕓豆蛋白(KBP)中富含天門(mén)冬氨酸、谷氨酸、精氨酸和亮氨酸等氨基酸，其氨基酸評(píng)分(AAS)、化學(xué)評(píng)分(CS)、必需氨基酸指數(shù)(EAAI)均高于大豆蛋白或乳清蛋白，必需氨基酸組成符合FAO/WHO標(biāo)準(zhǔn)模式，是一種優(yōu)質(zhì)植物蛋白和功能添加劑原料［2］。

蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)在提高食品品質(zhì)方面十分重要，蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)主要由其結(jié)構(gòu)決定。常見(jiàn)的蛋白質(zhì)改性方法有物理法、生物酶法和化學(xué)法等，物理改性是利用熱、電、磁、機(jī)械能等物理作用形式對(duì)蛋白的功能性加以改善，具有費(fèi)用低、安全性好、作用時(shí)間短、對(duì)產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)成分影響較小等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用前景廣闊［3］。物理改性方法主要有超聲波［4］、超高壓［5］、高壓脈沖［6］、微波［7］、熱誘導(dǎo)聚合［8］等，其中超聲波技術(shù)具有作用時(shí)間短、操作簡(jiǎn)單易控制及能耗較低等優(yōu)點(diǎn)，已被用于改善麥胚清蛋白［4］、小麥胚芽球蛋白［9］、大豆?jié)饪s蛋白［10］、小麥面筋蛋白［11］等植物蛋白的功能性質(zhì)。然而，關(guān)于超聲波處理對(duì)蕓豆蛋白理化和功能性質(zhì)影響的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

本試驗(yàn)研究了經(jīng)不同功率超聲波處理前后的KBP紫外光譜、熒光光譜、溶解度、吸油性、起泡性能和乳化性能的變化規(guī)律，以期為探索超聲波技術(shù)改善KBP理化性質(zhì)和功能性質(zhì)的方法提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

涇川白蕓豆，市售，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為22.47%，脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.56%(以干基計(jì))。

JY92－2超聲波細(xì)胞破碎儀:寧波新芝生物科技股份有限公司;TGL－16高速臺(tái)式冷凍離心機(jī):湘儀離心機(jī)廠;Cary50紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì):美國(guó)瓦里安中國(guó)有限公司;FD－1－55冷凍干燥機(jī):北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;960MC熒光光度計(jì):上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蕓豆蛋白(KBP)的提取

蕓豆精選、去皮烘干后粉碎，經(jīng)石油醚脫脂后過(guò)60目篩，低溫干燥得蕓豆粉。蕓豆粉以1∶10(g/mL)的料液比加入蒸餾水，在50℃、pH 9.0條件下恒溫?cái)嚢杼崛? h，然后3 000 r/min離心20 min，沉淀物再以1∶8(g/mL)比例提取2次。合并3次上清液，用1.0 mol/L HCl調(diào)節(jié)至pH 4.4，然后4 000 r/min 離心15 min，水洗沉淀 3次，用 0.5 mol/L NaOH 調(diào)至pH 7.0，攪拌使沉淀復(fù)溶后，倒入透析袋中，4℃下透析48 h后，冷凍干燥，所得產(chǎn)品即為冷凍干燥得到蕓豆蛋白［12］。

1.2.2 超聲波處理方法

取適量樣品溶液，置于超聲波細(xì)胞破碎儀中處理 5 min，超聲波功率分別為 100、200、300、400、500、600 W，處理后的樣品進(jìn)行理化性質(zhì)和功能性質(zhì)分析。

1.2.3 紫外光譜掃描

準(zhǔn)確稱(chēng)取0.5 g KBP溶于600 mL蒸餾水中，攪拌均勻，5 000 r/min離心5 min后取上清液進(jìn)行超聲波處理，處理后的樣品在200～800 nm范圍用紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì)掃描。

1.2.4 熒光光譜掃描

準(zhǔn)確稱(chēng)取0.5 g KBP溶于600 mL蒸餾水中，攪拌均勻，5 000 r/min離心5 min后取上清液進(jìn)行超聲波處理，處理后的樣品用熒光分光光度計(jì)掃描，掃描條件為激發(fā)波長(zhǎng)380 nm，發(fā)射波長(zhǎng)400～800 nm。

1.2.5 功能性質(zhì)的測(cè)定

1.2.5.1 溶解度的測(cè)定

配制1%的蛋白溶液，室溫?cái)嚢?0 min，然后3 000 r/min離心20 min，用半微量凱氏定氮法測(cè)定上清液中的蛋白質(zhì)濃度。溶解度表示為上清液蛋白質(zhì)濃度占總蛋白質(zhì)濃度的比例［13］。

1.2.5.2 起泡性能的測(cè)定

配制2%的蛋白溶液，在10 000 r/min條件下攪打1 min，迅速倒入500 mL量筒中，泡沫體積記為起泡性。靜置10 min后，再次測(cè)量泡沫體積，記為泡沫穩(wěn)定性［11］。

1.2.5.3 乳化性能的測(cè)定

配制3%的蛋白溶液50 mL，調(diào)節(jié)至pH 7.0，在12 000 r/min條件下室溫均質(zhì)30 s，加入50 mL大豆油，再均質(zhì)2 min，迅速將乳化液倒入2個(gè)50 mL的離心管中，2 700 r/min離心5 min，測(cè)量乳化層體積。上述方法所得混合液80℃保溫30 min，冷卻至室溫后2 700 r/min離心5 min，取出后測(cè)量乳化層體積［14］。計(jì)算乳化性(EA)和乳化穩(wěn)定性(ES)。

1.2.5.4 吸油性的測(cè)定

稱(chēng)取0.5 g蛋白(精確到0.001)和10 mL大豆油于離心管中混勻，室溫靜置30 min，然后8 000 r/min離心30 min，測(cè)定上清液體積，體積減少量即為樣品吸油量。吸油性表示為每克樣品吸附油的體積［15］。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，并取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波處理對(duì)KBP 紫外光譜的影響

蛋白質(zhì)產(chǎn)生紫外吸收主要是由于色氨酸和酪氨酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)對(duì)紫外光的吸收，其次是苯丙氨酸、組氨酸和半胱氨酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)以及肽鍵對(duì)紫外光的吸收［16］。超聲波處理對(duì)KBP紫外光譜的影響如圖1所示。由圖1可知，當(dāng)超聲波功率≤500 W時(shí)，超聲波處理后的KBP紫外吸光度均出現(xiàn)了不同程度降低。這可能是因?yàn)?，蛋白分子中二硫鍵的增加或巰基的減少，導(dǎo)致蛋白分子折疊，蛋白表面生色基團(tuán)的減少引起紫外吸光度降低，這說(shuō)明經(jīng)超聲波處理后的KBP空間結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。當(dāng)超聲功率為600 W時(shí)，紫外吸光度明顯高于未處理組(0 W)，隨著超聲波功率的提高，蛋白肽鏈伸展開(kāi)來(lái)，從有序的折疊態(tài)變?yōu)闊o(wú)序的去折疊態(tài)，以致本來(lái)被包含在內(nèi)部的色氨酸和酪氨酸殘基的疏水基團(tuán)裸露，使吸收強(qiáng)度增加［17］。

圖1 超聲波功率對(duì)蕓豆蛋白紫外光譜的影響曲線

2.2 超聲波處理對(duì)KBP熒光光譜的影響

超聲波處理對(duì)KBP熒光光譜的影響如圖2所示。由于KBP中色氨酸和酪氨酸的存在使其具有內(nèi)源熒光，在380 nm激發(fā)波長(zhǎng)下，KBP的最大發(fā)射波長(zhǎng)為560 nm。KBP經(jīng)超聲波處理后，熒光光譜的最大發(fā)射峰稍有藍(lán)移，熒光強(qiáng)度減弱或增強(qiáng)，但峰形未變，表明超聲波處理沒(méi)有破壞蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)，僅使疏水腔結(jié)構(gòu)和發(fā)色團(tuán)的微環(huán)境發(fā)生了不同程度的改變，疏水性增強(qiáng)。當(dāng)超聲波功率在100～500 W范圍內(nèi)，經(jīng)超聲波處理的KBP熒光強(qiáng)度明顯低于未處理組(0 W);超聲波功率為600 W時(shí)的KBP熒光強(qiáng)度則高于未處理組(0 W)。由圖2還可看出，隨著超聲功率的提高，激發(fā)熒光強(qiáng)度逐漸增加。因?yàn)?，隨著功率的增加，超聲波對(duì)介質(zhì)產(chǎn)生的空穴效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)和超混合效應(yīng)等作用增強(qiáng)，促使蛋白分子伸展，暴露出不同的生色基團(tuán)，從而改變了熒光強(qiáng)度的大小。另外，蛋白分子整體結(jié)構(gòu)復(fù)雜、芳香族氨基酸和熒光生色基團(tuán)分布不均、蛋白分子伸展或折疊方式不同，在超聲處理下都會(huì)引起蛋白熒光強(qiáng)度的差異［18］。

圖2 超聲波功率對(duì)蕓豆蛋白熒光光譜的影響

2.3 超聲波處理對(duì)KBP溶解度的影響

蛋白質(zhì)的溶解性與功能特性存在密切聯(lián)系，通過(guò)蛋白質(zhì)的溶解性來(lái)體現(xiàn)其他的功能特性。因此，溶解度是蛋白的重要功能特性之一［19］。由圖3可知，當(dāng)超聲波功率在0～300 W范圍內(nèi)，KBP溶解度與超聲波功率呈正相關(guān)關(guān)系，當(dāng)超聲波功率大于300 W時(shí)，溶解度增幅變緩，漸趨平穩(wěn)。因?yàn)椋环矫?，KBP中的谷氨酸、天冬氨酸和絲氨酸含量較高，經(jīng)超聲波處理后，其分子發(fā)生了伸展，這些氨基酸的充分暴露有利于溶解度的提高。另一方面，蛋白質(zhì)中的自由氨基群能和鄰近羧基群發(fā)生靜電引力，使蛋白分子聚集，溶解度下降;超聲波處理能夠打斷自由氨基群和鄰近羧基群之間的聯(lián)系，使溶解度得到提高［9］。再者，超聲波產(chǎn)生的空化效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)打開(kāi)蛋白聚集體的同時(shí)打斷了蛋白質(zhì)分子的四級(jí)結(jié)構(gòu)，形成溶于水的非共價(jià)鍵分子，與溶劑水的相互作用力加強(qiáng)，使其溶解度增加［20］。上述綜合作用，使得蛋白質(zhì)中的親水性氨基酸殘基向蛋白質(zhì)外部遷移，致使蛋白質(zhì)水合能力加強(qiáng)，溶解度提高。

圖3 超聲波功率對(duì)蕓豆蛋白溶解度的影響

2.4 超聲波處理對(duì)KBP起泡性能的影響

由圖4可知，隨著超聲波功率的增加，KBP的起泡性和起泡穩(wěn)定性呈先增后減的趨勢(shì)，當(dāng)超聲波功率為500 W時(shí)，起泡性和起泡穩(wěn)定性達(dá)到最大，分別134.5%和146.8%。一方面，超聲波處理改變了KBP的表面疏水性，而表面疏水基團(tuán)能夠促進(jìn)形成水－空氣界面;同時(shí)，表面疏水性增加意味著蛋白分子發(fā)生了伸展，而適度伸展的蛋白分子間能形成更為穩(wěn)定的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和界面膜，使超聲波處理后KBP的起泡性能增強(qiáng)。另一方面，當(dāng)超聲波功率進(jìn)一步增大時(shí)，KBP分子表面疏水性降低，這樣由蛋白分子間相互作用形成的穩(wěn)定網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和界面膜遭到破壞，產(chǎn)生的泡沫界面膜由于缺乏韌性而容易破裂，導(dǎo)致KBP的起泡性和起泡穩(wěn)定性開(kāi)始下降［4］。

圖4 超聲波功率對(duì)蕓豆蛋白起泡能力研究

2.5 超聲波處理對(duì)KBP乳化性能的影響

蛋白質(zhì)分子的兩親結(jié)構(gòu)使其在油水混合液中可以擴(kuò)散到油水界面形成油水乳化液，在油滴周?chē)纬梢粚幽ぃ苊庵镜木奂?，蛋白質(zhì)促使油和水形成乳化液，并保持乳化液穩(wěn)定的能力即為蛋白質(zhì)的乳化特性。由圖5可知，隨著超聲波功率的增加，KBP的乳化性和乳化穩(wěn)定性逐漸增加，但功率超過(guò)500 W時(shí)，乳化性和乳化穩(wěn)定性反而下降。這是因?yàn)?，一方面，?dāng)超聲波功率增大時(shí)，聲強(qiáng)增大，蛋白質(zhì)溶液受到的負(fù)壓也隨之增大，水分子間平均距離就會(huì)增大，超過(guò)極限距離后，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的完整性被破壞，造成空穴，蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)變得疏松，乳化能力及乳化穩(wěn)定性得到提高。當(dāng)功率繼續(xù)增大，蛋白質(zhì)變性增大，超聲波顯現(xiàn)出強(qiáng)烈的機(jī)械性斷鍵作用，不溶性蛋白質(zhì)含量增多，乳化性能隨之降低［21］。另一方面，蛋白質(zhì)的乳化性能與其表面疏水性存在一定關(guān)系，低功率超聲有利于蛋白分子疏水基團(tuán)的外露，使蛋白質(zhì)親水、疏水基團(tuán)增多，乳化能力增強(qiáng);但過(guò)高的功率又會(huì)使蛋白的表面疏水性顯著降低，乳化性能下降［22－23］。因此，超聲波功率的大小對(duì)KBP乳化性能改善至關(guān)重要。

圖5 超聲波功率對(duì)蕓豆蛋白乳化性的影響

2.6 超聲波處理對(duì)KBP吸油性的影響

蛋白質(zhì)的非極性區(qū)域和脂類(lèi)的非極性脂肪族鏈間存在疏水作用，蛋白質(zhì)與甘油三酸酯形成脂－蛋白復(fù)合物，因而具有吸油性。由圖6可以看出，在0～200 W范圍內(nèi)，隨著超聲波功率的增加，KBP的吸油性增加。因?yàn)?，超聲波作用使得蛋白分子原有?gòu)象發(fā)生變化，結(jié)構(gòu)變的疏松，將原來(lái)在分子內(nèi)部的一些非極性基團(tuán)暴露在分子表面，改善了蛋白分子的吸油性。但另一方面，超聲波功率繼續(xù)增大時(shí)，蛋白質(zhì)逐漸變性，不溶性蛋白增多，導(dǎo)致功率＞200 W時(shí)吸油性逐漸下降。

圖6 超聲波功率對(duì)蕓豆蛋白吸油性的影響

3 結(jié)論

超聲波對(duì)蛋白質(zhì)理化性質(zhì)及功能性質(zhì)的影響歸根結(jié)底是由于超聲波對(duì)其結(jié)構(gòu)變化產(chǎn)生了作用。通過(guò)對(duì)不同功率超聲波處理KBP后的紫外光譜和熒光光譜分析發(fā)現(xiàn)，超聲波處理改變了KBP的空間結(jié)構(gòu)。蛋白空間結(jié)構(gòu)的變化引起了功能性質(zhì)的改變。表現(xiàn)在，KBP的溶解度隨著超聲波功率的提高而增加，當(dāng)超聲波功率分別為400 W和500 W時(shí)，KBP的起泡性能和乳化性能最高，超聲波功率為200 W時(shí)，KBP的吸油性最高。研究表明，通過(guò)選擇適宜的超聲波功率水平能夠改善蕓豆蛋白的理化和功能性質(zhì)。

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