潘向昆 王瑛瑤 魏翠平 欒 霞 劉建學(xué) 段章群 侯冰冰

(河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院1，洛陽 471003)

(國家糧食局科學(xué)研究院2，北京 100037)

結(jié)構(gòu)脂質(zhì)(structured lipids，SLs)是天然油脂改性的一類特殊的脂肪。其通過一些條件(通常情況下是脂肪酶)來改變天然脂質(zhì)中脂肪酸的組成和位置，將某些特殊營養(yǎng)或者生理功能脂肪酸結(jié)合到特定位置，最大程度發(fā)揮合成脂質(zhì)中各種脂肪酸的功效，因此結(jié)構(gòu)脂質(zhì)又名重構(gòu)脂質(zhì)［1］。廣義上的結(jié)構(gòu)脂質(zhì)是指經(jīng)過重構(gòu)天然脂質(zhì)中甘三酯脂肪酸所在位置和組成改變，即天然油脂的改性產(chǎn)品，天然油脂的風(fēng)味和物性改變較少，保持了其在食品應(yīng)用的原來特性［2］。前人曾根據(jù)定位在甘油骨架脂肪酸將結(jié)構(gòu)脂質(zhì)分為定向結(jié)構(gòu)脂質(zhì)(SSL)和隨機(jī)結(jié)構(gòu)脂質(zhì)(SL)，定向結(jié)構(gòu)脂質(zhì)主要是指長鏈脂肪酸位于甘油骨架的Sn－2位，中鏈或短鏈脂肪酸位于Sn－1，3位的結(jié)構(gòu)脂質(zhì)(MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì))［3］。

三酰甘油骨架上的脂肪酸消化吸收代謝有特定的生理特點(diǎn)，機(jī)體內(nèi)的脂肪酶水解Sn－1，3位脂肪酸，以游離脂肪酸的形式被吸收，而Sn－2位脂肪酸則以單甘酯的形式被吸收［4］。以1，3特異性固定化脂肪酶催化中碳鏈脂肪酸辛酸制備的MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)，具有快速消化吸收代謝等特點(diǎn)，從而為特定人群快速提供能量，而且代謝后在體內(nèi)蓄積少，中鏈脂肪酸和相同質(zhì)量的長鏈脂肪酸相比產(chǎn)生的能量較少，因此還具有減肥等功效［5］。

采用填充床反應(yīng)器固定化酶催化制備MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)，具有反應(yīng)條件溫和、副產(chǎn)物少且產(chǎn)物便于回收［6］。固定化酶在結(jié)構(gòu)脂質(zhì)的制備上不僅具有特異性和專一性，而且增加酶的使用壽命，便于條件的調(diào)控。本試驗(yàn)以菜籽油和辛酸為底物，采用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析方法對影響固定化脂肪酶在填充床中酶催化制備MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)的因素進(jìn)行研究，以期得到最佳制備條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菜籽油:市購;辛酸、正己烷、異丙醇、乙酸乙酯及丙酮:均為色譜純，Sigma－Aldrich公司;固定化脂肪酶:Novozyme公司;其他試劑均為分析純:北京化工廠。

Waters Acouity型超高效液相色譜儀(配ELSD檢測器):美國Waters公司;R－215型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:BUCHI公司;2005－02型低速離心機(jī):國華機(jī)械有限公司;DK－S24型電熱恒溫水浴鍋:上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 固定化酶催化制備MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)

將水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)調(diào)到預(yù)增加值后的酶裝入固定床反應(yīng)器，按一定比例稱取底物菜籽油與辛酸混勻置于反應(yīng)器，將底物泵入固定床反應(yīng)器，控制反應(yīng)時(shí)間，制備混合產(chǎn)物。

1.2.2 MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)的純化

酶催化酸解反應(yīng)是在中碳鏈脂肪酸過量的條件下進(jìn)行的，得到的產(chǎn)物體系中存在大量的酸，在酶催化酸解反應(yīng)過程中除了生成不同類型(諸如MMM、MLM、LLM、LLL)的結(jié)構(gòu)脂質(zhì)以外，還會(huì)產(chǎn)生少量甘一脂、甘二脂等中間副產(chǎn)物。因此需要將產(chǎn)物進(jìn)行純化。

稱取酶催化酸解產(chǎn)物，按酸解產(chǎn)物/乙醇水溶液1∶3比例加入乙醇水溶液(乙醇水體積比70∶30)，劇烈搖勻15 min，3 500 r/min離心20 min，靜置15 min，分離出油相，重復(fù)3次，將最終得到的樣品溶于適量正己烷中，加入2滴酚酞，用0.5 mol/L的KOH乙醇水溶液(乙醇水體積比30∶70)滴定至乙醇水溶液變紅，靜置5 min，分離正己烷，加入無水硫酸鈉出水后旋蒸得到結(jié)構(gòu)脂質(zhì)。

1.2.3 超高效液相色譜分析方法

樣品制備:稱取1.2.2所得結(jié)構(gòu)脂質(zhì) 100 mg，置于5 mL容量瓶中用丙酮定容。過0.22 μm聚四氟乙烯濾膜后取0.2 μL進(jìn)UPLC(超高效液相色譜)分析。

1.2.4 超高效液相色譜分析條件［7］

采用 BEH C18 柱(2.1 mm ×100 mm，1.7 μm);流動(dòng)相:丙酮/乙腈(體積比65∶35);ELSD溫度:40℃;氮?dú)鈮毫?2.1 MPa。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 反應(yīng)時(shí)間的影響

圖1 反應(yīng)時(shí)間對酶催化酸解制備MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)含量的影響

在酶量為10 g(水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.15%)，底物物質(zhì)的量比(菜籽油/辛酸)為1∶4，反應(yīng)溫度為60℃條件下，考察反應(yīng)時(shí)間對酶催化酸解反應(yīng)的影響，結(jié)果見圖1。從圖1可以看出，隨反應(yīng)時(shí)間的增加，MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)物質(zhì)的量分?jǐn)?shù)逐漸升高，反應(yīng)時(shí)間為2 h時(shí)，MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)含量基本不變，反應(yīng)達(dá)到平衡。隨著延長反應(yīng)時(shí)間，MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)的含量雖然有所增加，但是增幅較緩，考慮到試驗(yàn)成本、時(shí)間成本和MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)含量增加量等各因素，選擇反應(yīng)時(shí)間為2 h較優(yōu)。

2.1.2 底物物質(zhì)的量比的影響

在加酶量為10 g(水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.15%)，反應(yīng)溫度為55℃，反應(yīng)時(shí)間為2 h的條件下，考察底物物質(zhì)的量比對酶催化酸解反應(yīng)的影響，結(jié)果見圖2。從圖2可以看出，隨著底物物質(zhì)的量比增大，MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)含量逐漸升高，符合反應(yīng)方程動(dòng)力學(xué)，反應(yīng)物的增加會(huì)使方程向產(chǎn)物增加的方向進(jìn)行。隨著底物物質(zhì)的量比繼續(xù)增大，酶的催化效率會(huì)受到影響，一方面底物的增多會(huì)導(dǎo)致酶的競爭性抑制，另一方面在本試驗(yàn)中過多的辛酸會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)體系酸值較低，會(huì)導(dǎo)致酶活的降低甚至失活［8］。綜合考慮酶的使用壽命和后續(xù)對產(chǎn)物的分離純化，選擇菜籽油辛酸底物物質(zhì)的量比1∶4。

圖2 底物物質(zhì)的量比對酶催化酸解制備MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)含量的影響

2.1.3 反應(yīng)溫度的影響

在加酶量為10 g(水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.15%)，底物物質(zhì)的量比為1∶4，反應(yīng)時(shí)間為2 h的條件下，考察反應(yīng)溫度對酶催化酸解反應(yīng)的影響，結(jié)果見圖3。從圖3可以看出，隨著反應(yīng)溫度的升高，MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)的含量也隨之增加，在溫度為55℃時(shí)反應(yīng)體系中的MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)含量達(dá)到平衡，隨著溫度的繼續(xù)升高，MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)的含量會(huì)有所降低，這也說明溫度是影響?；D(zhuǎn)移的主要因素［9］?？紤]到連續(xù)試驗(yàn)遇到的酶活降低等問題，選擇在酶的溫度耐受性范圍內(nèi)，通過提高反應(yīng)溫度來保證酶的催化酸解效率，選取反應(yīng)溫度55℃。

圖3 反應(yīng)溫度對酶催化酸解制備MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)的影響

2.1.4 水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

在加酶量為10 g，反應(yīng)溫度為55℃，底物物質(zhì)的量比為1∶4，反應(yīng)時(shí)間為2 h，水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為 0%、0.05%、0.10%、0.20%、0.30%、0.50%、1%條件下，考察對酶催化酸解反應(yīng)制備MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)含量的影響，結(jié)果見圖4。從圖4可以看出水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加值對MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)的含量影響比較復(fù)雜，這是由于酶的催化反應(yīng)是建立在酶特有的空間構(gòu)型，水對于酶維持活性構(gòu)型至關(guān)重要，但是過多的含水量一方面使底物與酶的活性位點(diǎn)較難結(jié)合，導(dǎo)致反應(yīng)速率的降低，另一方面會(huì)使反應(yīng)由酯化反應(yīng)向水解反應(yīng)轉(zhuǎn)變，導(dǎo)致生成目標(biāo)產(chǎn)物的減少［10］。

圖4 水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)對酶催化酸解制備MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)的影響

2.2 響應(yīng)面分析法優(yōu)化MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)制備條件

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取反應(yīng)時(shí)間、底物物質(zhì)的量比、反應(yīng)溫度、水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為試驗(yàn)因素，MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)含量為指標(biāo)。各因素的水平編碼見表1。

運(yùn)用Design－Expert 7.0.0數(shù)學(xué)軟件設(shè)計(jì)四因素三水平的中心組合試驗(yàn)，分析研究影響填充床固定化酶催化制備MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)含量主要因素，包括29個(gè)試驗(yàn)，其中24個(gè)位析因試驗(yàn)點(diǎn)，5個(gè)中心試驗(yàn)點(diǎn)，見表2。

表1 Central composite因素及水平編碼表

表2 Central composite試驗(yàn)設(shè)計(jì)及MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)含量測量值

2.2.2 模型的建立及顯著性分析

根據(jù)表2的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，以MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)含量(R1)為響應(yīng)值，利用 Design－Expert 7.0.0 數(shù)學(xué)軟件對填充床制備MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)進(jìn)行多元回歸擬合，得到二次多項(xiàng)回歸方程:

R1=42.10+1.80A+1.30B+3.88C+4.55D+0.84AB+2.21AC － 1.01AD+0.82BC+1.55BD+2.24CD －6.90A2－5.96B2－3.30C2－3.78D2

由表3可知，填充床酶催化制備MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)含量回歸模型極顯著(P＜0.01)。模型一次項(xiàng)均極顯著，顯著性順序是D(水分質(zhì)量分?jǐn)?shù))＞C(反應(yīng)溫度)＞A(保留時(shí)間)＞B(底物物質(zhì)的量比);二次項(xiàng)AB，BC交互項(xiàng)為顯著，其余均為極顯著，表明各試驗(yàn)因素對響應(yīng)值的影響不是線性關(guān)系。預(yù)測方程的決定系數(shù)R2=0.992 2，模型的偏離系數(shù)為5.12%，，說明方程的擬合度和可信度較高，可以較好地代表反應(yīng)參數(shù)和響應(yīng)值之間的關(guān)系，可以用上述回歸方程對填充床酶催化制備MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)含量進(jìn)行分析預(yù)測和確定最佳生產(chǎn)工藝條件。

表3 二次多項(xiàng)式回歸模型ANOVA分析

2.2.3 各影響因素的交互作用分析

2.2.3.1 反應(yīng)時(shí)間與底物物質(zhì)的量比的交互影響

圖5顯示了在反應(yīng)溫度為55℃和水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.10%下，反應(yīng)時(shí)間和底物物質(zhì)的量比對填充床制備MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)含量的交互影響。在底物物質(zhì)的量比不變的條件下，隨著反應(yīng)時(shí)間的逐漸增加，MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)含量出現(xiàn)先增大后減小的趨勢，這是由于隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)含量增大，達(dá)到平衡后，反應(yīng)時(shí)間的增加會(huì)使結(jié)構(gòu)脂質(zhì)出現(xiàn)?；D(zhuǎn)移明顯增大，導(dǎo)致MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)含量的減少。反應(yīng)時(shí)間不變的條件下，隨著底物物質(zhì)的量比的增大，MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)含量出現(xiàn)先增大后減小現(xiàn)象。

2.2.3.2 反應(yīng)時(shí)間與反應(yīng)溫度的交互影響

圖6顯示了在底物物質(zhì)的量比為4∶1和水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.10%下，反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度對填充床制備MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)含量的交互影響。在反應(yīng)時(shí)間不變的條件下，隨著反應(yīng)溫度的逐漸增大，MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)含量出現(xiàn)先增大后減小，原因在于反應(yīng)溫度的增大，逐漸接近酶的最適溫度使酶活逐漸達(dá)到最大，當(dāng)超過最適溫度時(shí)酶活受到抑制從而使MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)含量出現(xiàn)下降。在反應(yīng)溫度不變的條件下，隨著反應(yīng)時(shí)間的逐漸增加，MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)含量出現(xiàn)先增大后減小的趨勢。

2.2.3.3 反應(yīng)時(shí)間與水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的交互影響

圖7顯示了在底物物質(zhì)的量比為4∶1和反應(yīng)溫度為55℃下，反應(yīng)時(shí)間和水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)對填充床制備MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)含量的交互影響。在反應(yīng)時(shí)間不變的條件下，隨著水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的逐漸增大，MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)含量隨之增加，達(dá)到最大后出現(xiàn)較小幅度的下降，原因在于水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加使酶活性位點(diǎn)充分暴露從而使催化效率增大，當(dāng)水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)繼續(xù)增大會(huì)使產(chǎn)物發(fā)生水解反應(yīng)。在水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)不變的條件下，隨著反應(yīng)時(shí)間的逐漸增加，MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)含量出現(xiàn)先增大后減小的趨勢。

2.2.3.4 底物物質(zhì)的量比與反應(yīng)溫度的交互影響

圖8顯示了在反應(yīng)時(shí)間2 h和水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.10%下，底物物質(zhì)的量比和反應(yīng)溫度對填充床制備MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)含量的交互影響。在反應(yīng)溫度不變的條件下，隨著底物物質(zhì)的量比的逐漸增加，MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)含量出現(xiàn)先增大后減小的趨勢，原因在于隨著底物物質(zhì)的量比的增大，會(huì)使反應(yīng)向著產(chǎn)物增加的方向進(jìn)行，但當(dāng)?shù)孜镂镔|(zhì)的量比達(dá)到一定程度時(shí)，反應(yīng)體系的pH很低，一方面導(dǎo)致酶活的降低甚至喪失，另一方面也會(huì)使反應(yīng)產(chǎn)物發(fā)生酸解。當(dāng)?shù)孜镂镔|(zhì)的量比不變的條件下，隨著反應(yīng)溫度的增加，MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)含量出現(xiàn)先增大后減小的趨勢，但是減少較小。

2.2.3.5 底物物質(zhì)的量比與水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的交互影響

圖9顯示了在反應(yīng)時(shí)間2 h和反應(yīng)溫度為55℃下，底物物質(zhì)的量比和水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)對填充床制備MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)含量的交互影響。在所選的范圍內(nèi)存在極值，即存在響應(yīng)面最高點(diǎn)。沿水分含量軸向等高線較沿底物物質(zhì)的量比軸向等高線密集，說明水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)對MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)含量影響比底物物質(zhì)的量比顯著。

2.2.3.6 反應(yīng)溫度與水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的交互影響

圖10顯示了在反應(yīng)時(shí)間2 h和底物物質(zhì)的量比為4∶1時(shí)，反應(yīng)溫度和水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)對填充床制備MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)含量的交互影響。反應(yīng)溫度和水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)對MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)含量影響都較顯著，當(dāng)反應(yīng)溫度較低時(shí)，水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加對MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)含量影響較為明顯，出現(xiàn)先增大后減小的趨勢。當(dāng)溫度達(dá)到一定程度時(shí)，隨著水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)含量減小的趨勢減緩。綜合圖5～圖10可知，4個(gè)試驗(yàn)因素對填充床制備MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)含量的影響均不是簡單的線性關(guān)系，且影響都極顯著。水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)是影響填充床制備MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)含量的最主要因素，其次是反應(yīng)溫度，底物物質(zhì)的量比對其影響最小。

2.2.4 制備MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)最佳條件的確定及驗(yàn)證

通過Design－Expert 7.0.0數(shù)學(xué)軟件得出最佳制備MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)條件:保留時(shí)間為2.12 h，底物物質(zhì)的量比為4.32，反應(yīng)溫度為60.14℃，水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.15%?；貧w方程預(yù)測MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)摩爾分?jǐn)?shù)為46.66%。

在實(shí)際的操作過程中，填充床固定化酶制備MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)工藝條件為:保留時(shí)間為2 h，底物物質(zhì)的量比為4.5，反應(yīng)溫度為60℃，水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.15%。得到 MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)摩爾分?jǐn)?shù)為46.12%，與理論預(yù)測值基本一致，相對誤差為1.16%。說明回歸方程與實(shí)際情況擬合很好，驗(yàn)證了所建立模型的正確性，該工藝參數(shù)具有實(shí)用價(jià)值。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過 Design－Expert 7.0.0數(shù)學(xué)軟件分析保留時(shí)間、底物物質(zhì)的量比、反應(yīng)溫度和水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)等因素對制備MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)的影響，優(yōu)化確定填充床固定化酶催化制備MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)的最佳工藝條件:保留時(shí)間為2 h，底物物質(zhì)的量比為4.5，反應(yīng)溫度為60℃，水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.15%。在此工藝條件下MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)物質(zhì)的量分?jǐn)?shù)為46.12%，在最佳工藝條件下重復(fù)試驗(yàn)MLM型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)物質(zhì)的量分?jǐn)?shù)為46.66%，與方程模型預(yù)測一致。

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