郭金龍 邢麗萍 王玉芬 孫國琴

(1.內(nèi)蒙古清谷新禾有機食品集團有限責(zé)任公司,呼和浩特 010051;2.內(nèi)蒙古大學(xué),呼和浩特 010021;3.內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院,呼和浩特 010030)

杏鮑菇 (Pleurotus eryngii(DC.)Qué l.),別名刺芹側(cè)耳,隸屬于擔(dān)子菌綱,傘菌目,側(cè)耳科,側(cè)耳屬[1]。杏鮑菇菌肉肥厚,質(zhì)地脆嫩,具有杏仁香味和類似鮑魚的口感,適合保鮮、加工,深得人們的喜愛,享有 “平菇王”的美譽。杏鮑菇寡糖含量豐富,與雙歧桿菌共用,有改善腸胃功能和美容的效果[2],入藥有降血壓、降血脂、降低膽固醇和增強肌體免疫力之功效[3]。多糖是杏鮑菇中具有生物活性的主要有效組分之一,國內(nèi)研究2003年才見報道[4]。近幾年的研究結(jié)果表明,杏鮑菇所含的真菌多糖具有抗氧化、降血脂、抑制腫瘤、抗病毒、抗過敏、抗衰老、降低膽固醇和增強機體免疫的功效[5～7]。杏鮑菇子實體和液體發(fā)酵菌絲體都可作為多糖提取的原料。俞苓等[4]用熱水浸提結(jié)合酶法試驗結(jié)果表明,果膠酶和中性蛋白酶均可大大提高多糖得率,可分別達368 mg/g粗多糖和176 mg/g粗多糖。侯軍等[8]響應(yīng)面優(yōu)化法能夠提高杏鮑菇菌糠的多糖提取率,最大提取率達6.43%。

由于子實體生產(chǎn)周期長,勞動強度大,易受氣候影響,產(chǎn)品的產(chǎn)量及質(zhì)量不穩(wěn)定,且子實體木質(zhì)化程度高,因此人工栽培子實體的多糖提取利用率較低。而采用生物發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)杏鮑菇菌絲體,周期短、成本低、產(chǎn)量大,具有工業(yè)化生產(chǎn)前景[9]。相關(guān)研究表明,發(fā)酵法獲得的菌絲體和人工栽培的子實體,不管是多糖含量,還是多糖的藥理效果,兩者都比較接近,在有些情況下菌絲體多糖的含量和藥理效果比子實體還要好[10]。因此本試驗選擇杏鮑菇菌絲體作為原料,探討多糖提取方法,利用正交試驗對熱水浸提法提取杏鮑菇多糖的最佳工藝進行了優(yōu)化,為深入研究杏鮑菇菌絲體多糖奠定基礎(chǔ),也為杏鮑菇保健食品的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料與儀器 試驗材料:通過液體發(fā)酵得到的杏鮑菇菌絲體,無水乙醇、葡萄糖、苯酚、濃硫酸 (以上均為分析純),碘-碘化鉀溶液。所用儀器:貝克曼離心機64R(3萬轉(zhuǎn))、JY92-2D超聲波細(xì)胞粉碎機、電熱鼓風(fēng)干燥箱、HHS型電熱恒溫水浴槽、ZK-2BS型真空干燥箱、BW320S電子天平。

1.2 試驗方法

(1)菌絲體發(fā)酵培養(yǎng)。將斜面試管菌種接種于液體搖瓶中,25℃、150 r/min條件下培養(yǎng)7天制成液體母種,然后將母種以2%接種量接入液體搖瓶培養(yǎng)基中,培養(yǎng)10天左右得到菌絲體原料。

多糖提取工藝流程:菌絲體→洗滌→破碎→熱水浸提→離心 (25℃)→上清液真空濃縮→醇析→離心 (4℃)→乙醇洗滌→真空干燥→粗多糖成品。

(2)醇析多糖條件研究。①乙醇加入量的選擇:取濃縮后的浸提液各10 mL,分別加入95%的乙醇10 mL、20 mL、30 mL、40 mL、50 mL,密封,在低溫 (4℃)下放置過夜,收集粗多糖,按照苯酚-硫酸法測定多糖含量,并計算多糖得率。②醇析時間的選擇:取濃縮后的浸提液各10 mL,加入上述試驗確定的乙醇量,密封,在低溫下分別放置2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h,收集粗多糖,按照苯酚-硫酸法測定多糖含量,并計算多糖得率。

(3)菌絲體細(xì)胞壁破碎方法的研究。菌絲體在熱水浸提前需要進行細(xì)胞破碎,目的是提高多糖的溶出率和縮短浸提時間,試驗比較了以下3種方法對杏鮑菇多糖提取率的影響。

①烘干粉碎法:屬于傳統(tǒng)方法,將菌絲體在60℃電熱鼓風(fēng)干燥箱中烘干,用研缽粉碎,過60目篩。

②超聲破碎法:采用JY92-2D型超聲波細(xì)胞粉碎機,變輻桿Φ 6,功率600 W。

③低溫凍融法:將菌絲體冷凍 (約-15℃),然后室溫融化,反復(fù)多次。

(4)杏鮑菇菌絲體多糖的浸提條件研究。①浸提溫度選擇試驗:確定料液比 (菌絲體濕重g/蒸餾水體積mL)為1∶8,浸提時間1 h不變的條件下,比較不同浸提溫度對多糖得率的影響,以選擇最佳浸提溫度。②浸提時間選擇試驗:在料液比1∶8,及由上述試驗確定的浸提溫度不變的條件下,比較不同浸提時間對多糖得率的影響,根據(jù)其多糖得率確定最佳浸提時間。③浸提料液比試驗:在上述試驗確定的最佳溫度、最佳時間不變的條件下,選擇不同的料液比提取多糖,根據(jù)多糖得率確定最佳料液比。

(5)正交試驗。根據(jù)單因子試驗確定的條件范圍,通過L9(34)正交試驗,得出最佳浸提條件。

(6)多糖含量的測定。稱取粗多糖樣品0.01 g左右,加入100 mL蒸餾水中沸水浴30 min溶解多糖并定容至250 mL,得杏鮑菇多糖溶液。采用苯酚-硫酸比色法[11]測定吸光度,并計算多糖含量。

多糖得率 (%)=多糖含量/菌絲體干重×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇加入量對多糖得率的影響 醇析試驗中乙醇加入量對杏鮑菇多糖得率的影響見圖1。從圖1可知,乙醇加入量1～3倍時多糖得率漸次明顯增加,說明乙醇加入量小于3倍時,多糖沉淀不完全;而乙醇加入量大于3倍后,多糖得率趨于平緩,說明3倍的乙醇加入量已基本能把多糖完全沉淀下來,再增加乙醇用量意義不大。從經(jīng)濟角度考慮,選擇3倍為醇析時的乙醇加入量。

2.2 醇析時間對多糖得率的影響 醇析試驗中醇析時間對杏鮑菇多糖得率的影響見圖2。從圖2可以看出,醇析時間小于4 h多糖得率增加明顯,說明多糖沉淀不完全;醇析6 h以上曲線變得平緩;8 h后多糖得率無明顯增加,說明此時多糖已沉淀完全。因此醇析時間選擇8 h是恰當(dāng)?shù)摹?/p>

2.3 低溫凍融法對多糖得率的影響 采用低溫反復(fù)凍融的方法處理杏鮑菇菌絲體,并以傳統(tǒng)的烘干粉碎法作對照,結(jié)果表明,隨著低溫凍融次數(shù)的增加,杏鮑菇多糖得率略有增加,但增加量很小,即使反復(fù)凍融5次,多糖得率仍然在1%左右,遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)烘干粉碎法 (圖3)?？梢姷蜏貎鋈诜ㄆ扑樽饔幂^弱,只適用于細(xì)胞壁較脆弱的微生物菌體,而不適用于細(xì)胞壁較厚的杏鮑菇菌絲體。

圖1 乙醇加入量對多糖得率的影響

圖2 醇析時間對多糖得率的影響

2.4 超聲波法對多糖得率的影響 采用超聲波以不同方式處理杏鮑菇菌絲體,并以傳統(tǒng)的烘干粉碎法作為對照,結(jié)果是,只進行 10 min超聲破壁而不進行熱水浸提,多糖得率比傳統(tǒng)的烘干粉碎法低,僅為超聲處理5 min并進行熱水浸提的50.32%。說明超聲處理不能完全取代熱水浸提的作用。超聲處理10 min多糖得率達到最高,為 4.73%,再繼續(xù)延長超聲處理時間,多糖得率反而有下降的趨勢,這可能是因超聲波處理時間過長,導(dǎo)致多糖結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,糖鏈斷裂,多糖得率下降 (圖4)。因此,應(yīng)選擇超聲處理10 min并進行熱水浸提為最佳的處理條件。

2.5 不同浸提溫度對多糖得率的影響 分別在60℃、70℃、80℃、90℃、沸水 (97℃)時提取杏鮑菇多糖,測定多糖得率,結(jié)果為:浸提溫度對多糖得率有很大影響,80℃以下多糖的浸提得率隨著溫度的升高而明顯增加;80～97℃多糖浸提得率增加趨于平緩;在溫度為97℃的沸騰狀態(tài),多糖得率最高 (圖5)。因此,97℃宜作為杏鮑菇菌絲體多糖的浸提溫度。

2.6 不同浸提時間對多糖得率的影響 分別選取浸提時間1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h、3.5 h、4 h提取杏鮑菇多糖,測定多糖得率,結(jié)果如圖6所示:提取時間在1～2 h之間,多糖得率是逐漸增大的;繼續(xù)延長加熱時間,多糖得率反而漸趨減少。因此,浸提時間選擇2 h是比較合理的。

2.7 不同料液比對多糖得率的影響 按照1∶6、1∶8 、 1∶10、 1∶12、1∶14、 1∶16、1∶18、1∶20 的料液比,分別提取杏鮑菇菌絲體多糖,測定多糖得率的結(jié)果 (圖7),料液比由1∶6到 1∶10時,多糖得率直線上升,繼續(xù)增大加水量多糖得率變化不大。因此,選用1∶10料液比較為合理。

圖3 凍融處理對多糖得率的影響

圖4 超聲波處理對多糖得率的影響

圖5 浸提溫度對多糖得率的影響

圖6 浸提時間對多糖得率的影響

2.8 正交試驗結(jié)果與分析 根據(jù)以上單因子試驗結(jié)果,3個因子中最優(yōu)條件分別為:浸提溫度97℃、浸提時間2 h、料液比1∶10。因此,在正交試驗時各因子的水平依表1選取;試驗計算結(jié)果如表2所示。

從表2可以看出,對多糖得率的影響,3個因子中,A因子 (浸提溫度)的極差最大,B因子 (浸提時間)次之,C因子 (料水比)最小。熱水浸提法提取杏鮑菇菌絲體多糖的最佳工藝組合為A3B3C1,即浸提溫度97℃,浸提時間3 h,料液比1∶8。但由于浸提時間2 h和3 h的k值僅相差0.04,而在生產(chǎn)上則要付出更多的能耗。為了達到最佳的經(jīng)濟效益,生產(chǎn)上應(yīng)該選組合A3B2C1,即浸提溫度97℃、浸提時間2 h、料液比1∶8的工藝組合。

運用SPSS(13.0)統(tǒng)計分析軟件[12]對表2結(jié)果進行方差分析,結(jié)果見表3。從表3可以看出,浸提溫度的顯著值(Sig.)為0.033(0.01＜P＜0.05),有顯著性影響;浸提時間和料液比的顯著值 (Sig.)分別為0.198和0.600(P＞0.05),無顯著影響。說明在所選擇的水平范圍內(nèi),浸提溫度的改變對多糖得率有顯著的影響,其他2個因子對多糖得率的影響不顯著。影響因子重要性順序為A＞B＞C。

3 結(jié)論和討論

3.1 結(jié)論

(1)菌絲體細(xì)胞破碎方法選擇超聲波法。低溫凍融法不適合杏鮑菇菌絲體細(xì)胞破碎。超聲波法與烘干粉碎法相比,前者不必將菌絲體烘干,既簡化了提取工藝,又提高了多糖得率。

(2)醇析時優(yōu)化工藝條件為:3倍體積95%乙醇沉淀8 h以上。

(3)浸提溫度97℃、浸提時間2 h、料液比1∶8為最佳浸提工藝條件。在此條件下,菌絲體多糖的提取率可達6.52%,較未優(yōu)化前提高近1倍。

3.2 討論

(1)杏鮑菇多糖。自從真菌多糖抑制腫瘤的活性被發(fā)現(xiàn)以后,真菌多糖越來越受人們的關(guān)注,成為生物化學(xué)、免疫學(xué)、醫(yī)藥學(xué)和食品科學(xué)等學(xué)科的一個非?；钴S的研究領(lǐng)域。盛偉等[3]對來源于白靈菇、杏鮑菇、阿魏菇3種不同菌類的多糖進行體外抗氧化活性研究,發(fā)現(xiàn)杏鮑菇對超氧陰離子自由基的清除能力最強,杏鮑菇子實體干品中多糖含量高達9.9%,它與胃腸中的雙岐桿菌共同作用,具有很好的促進消化、吸收功能,是理想的美容、保健食品。挖掘食用菌潛力,提高其產(chǎn)品附加值,是食用菌工作者的責(zé)任和義務(wù),我們正在采用離子束誘變技術(shù)試圖提高菌絲體中的多糖含量,同時必須探索先進的提取技術(shù)將其從菌絲體中提取出來。這正是本文研究的要旨。

(2)菌絲體的前處理。多糖的提取方法常用的有熱水浸提法、酸提法、堿提法、酶法等。稀酸、稀堿條件下,易使部分多糖發(fā)生水解,從而破壞多糖的活性結(jié)構(gòu),使多糖的得率減少。用酶法提取雖然條件溫和,但是成本太高。因此,我們采用熱水浸提法,并通過超聲破碎法和低溫凍融法處理菌絲體細(xì)胞來彌補傳統(tǒng)熱水浸提法需要多次浸提,多糖得率低的缺點。

圖7 料液比對多糖得率的影響

表1 正交試驗因子水平表

表2 正交試驗結(jié)果

(3)利用正交設(shè)計優(yōu)化提取工藝。正交設(shè)計的基本特點是用部分試驗來代替全面試驗,通過對部分試驗結(jié)果的分析,了解全面試驗的情況。如本試驗對浸提溫度、浸提時間、料液比3因子,每個因子3水平試驗,若不考慮交互作用,可利用正交表L9(34)安排,試驗方案僅包含9個水平組合,就能反映試驗方案包含27個水平組合的全面試驗的情況,找出最佳的生產(chǎn)條件,再參考單因子試驗確定各因素的水平,利用正交試驗得出浸提時的最佳浸提工藝條件,并通過工業(yè)生產(chǎn)經(jīng)濟核算,最終確定生產(chǎn)中的最佳浸提工藝條件,為食用菌的精深加工提供科學(xué)技術(shù)依據(jù)。

表3 試驗結(jié)果的方差分析

[1]姚自奇,蘭 進.杏鮑菇研究進展[J].食用菌學(xué)報,2004,11(1):52-58.

[2]陳士瑜,陳海英.蕈菌醫(yī)方集成[M].上海:上海科學(xué)技術(shù)文獻出版社,2000:429-430.

[3]盛 偉,方曉陽,吳 萍.白靈菇、杏鮑菇、阿魏菇多糖體外抗氧化活性研究[J].食品工業(yè)科技,2008,29(5):103-106.

[4]俞 苓,劉民勝,陳有容.杏鮑菇菌絲體多糖提取方法[J].食品工業(yè),2003,(3):17-19.

[5]張俊會,王 謙.杏鮑菇多糖的抗氧化活性研究[J].中國食用菌,2003,22(2):38-39.

[6]楊立紅,史亞麗,王曉潔,卜慶梅,蔡德華.杏鮑菇多糖的分離純化及生物活性的研究[J].食品科技,2005,(6):18-21.

[7]遲桂榮.杏鮑菇菌絲液體深層發(fā)酵產(chǎn)生多糖的分離純化及生物學(xué)活性研究[J].德州學(xué)院學(xué)報,2006,22(4):108-110.

[8]侯 軍,林曉民,李 瑛.響應(yīng)面法優(yōu)化杏鮑菇菌糠多糖提取工藝[J].食品科學(xué),2010,31(24):155-158.

[9]孟艷瓊,宋 敏,彭 凡,樊美珍.杏鮑菇深層發(fā)酵工藝的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2003,30(3):337-341.

[10]劉祖同,羅信昌.食用蕈菌生物技術(shù)及應(yīng)用[M].北京:清華大學(xué)出版社,2002.

[11]張 青,張?zhí)烀?苯酚-硫酸比色法測定多糖含量[J].山東食品科技,2004,(7):17-18.

[12]何秋月.SPSS在L9(34)正交試驗數(shù)據(jù)處理中的應(yīng)用[J].中國中醫(yī)藥現(xiàn)代遠(yuǎn)程教育,2005,3(12).