柏 錫，狄少康，張秀芹，朱延明

（東北農業(yè)大學生命科學學院，哈爾濱 150030）

草莓（Fragaria ananassa Duch.）屬薔薇科草莓屬多年生草本植物，是世界上廣泛栽培的重要經濟果樹[1]。由于草莓基因的高度雜合性和染色體的多倍性，受到有益性狀定向改良難、育種范圍窄、耗時長等限制。James等獲得第一棵草莓轉基因植株，標志著草莓基因工程開始[2]。此后，草莓遺傳轉化研究進入實用性階段，它可以有目的、有計劃地向草莓引入優(yōu)良性狀而不需要改變它原有其他特性，使草莓品種改良具有定向性和預見性，獲得常規(guī)育種難以或無法得到的新類型，從而創(chuàng)造出新種質。目前已獲得抗病[3]、抗蟲[4]、抗逆、抗除草劑和品質改良等方面轉基因植株。

目前，在草莓上采用的遺傳轉化方法主要有農桿菌介導法、基因槍法和電擊法等。目前應用于草莓上的基因導入法主要是農桿菌介導葉盤法[5-6]，以葉盤法獲得轉基因草莓新品種的前提條件就是要建立一個高效穩(wěn)定葉盤再生受體系統(tǒng)?；蛐?、外植體[7]、pH、生長調節(jié)劑的種類、配比與濃度以及AgNO3[8]等對草莓葉片不定芽再生都具有顯著影響。于冬梅等研究發(fā)現(xiàn)20～30 d葉齡的草莓葉片為誘導分化不定芽最適葉齡[9]。陳琴芳等研究發(fā)現(xiàn)，章姬在TDZ 8.0 mg·L-1時再生率最高為60.5%，豐香則在TDZ 2.0 mg·L-1時再生率最高為58%，并確定TDZ 1.0 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1的培養(yǎng)基為草莓基本再生培養(yǎng)基[10]。張利義等研究發(fā)現(xiàn)，全明星在MS+TDZ 1.5 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1再生效果好，再生率高達86.6%[11]。應用基因工程手段在基因水平上改良草莓品種已取得一定進展，但仍然存在轉化效率低、外源基因表達強度不夠、遺傳轉化系統(tǒng)不完善等問題。利用該法，由于共培養(yǎng)中農桿菌侵染，選擇再生培養(yǎng)基選擇壓，抗生素作用以及繼代培養(yǎng)等因素，會導致轉化外植體比非轉化外植體再生頻率有不同程度降低，即植物基因轉化頻率較低。所以，對葉盤遺傳轉化的優(yōu)化，也是提高轉化效率的關鍵因素。袁維風等報道OD值為0.3～0.5的工程菌侵染液對草莓遺傳轉化最適宜[12]。侵染濃度和侵染時間也是影響轉化效率的關鍵因素。菌液濃度過高或侵染時間太長，農桿菌繁殖增多，極不利于后期除菌。濃度太低或時間過短，又不利于菌體附著在外植體上，T-DNA不能有效整合，大大降低轉化效率。一般認為，草莓在菌液濃度OD600為0.5中浸泡5 min為宜。最佳侵染時間可能與不同的轉化材料和農桿菌株以及工程菌液濃度有關。預培養(yǎng)時間為2～4 d時，其轉化效果較好。未經預培養(yǎng)的葉片轉化效率低下。

本研究為建立草莓高頻植株再生體系，系統(tǒng)地探討了不同基因型、PGR配比、葉盤放置方式及葉片幼嫩程度等對草莓不定芽分化的影響。通過對草莓遺傳轉化影響因素的探討，建立農桿菌介導的草莓葉盤高效遺傳轉化體系，并以t-PA為目的基因，進行大規(guī)模遺傳轉化，獲得大量轉基因植株。

1 材料與方法

1.1 材料及菌株

草莓主栽品種弗吉尼亞、哈尼、森嘎拉和戈雷拉由東北農業(yè)大學果樹研究室提供。

含有載體pBET、pBEMT、pBFMT的大腸桿菌DH5α、農桿菌LBA4404（pAL4404）由東北農業(yè)大學植物生物工程研究室保存，該載體分別攜帶有不同啟動子誘導的t-PA基因和NPTⅡ篩選標記。

1.2 培養(yǎng)基

培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，在培養(yǎng)不同階段，分別加入不同生長激素和調節(jié)劑，具體見表1。

表1 組織培養(yǎng)中主要培養(yǎng)基及其成分Table1 Components of medium at different plant growth stages

1.3 草莓再生體系的探討

1.3.1 探討不同基因型及PGR配比對不定芽分化的影響

分別取4種基因型繼代20～30 d左右的草莓無菌試管苗幼嫩葉片為試材，用打孔器打成直徑為4 mm葉盤，近軸面向下接種在不同PGR（Plant growth regulator）配比的不定芽誘導培養(yǎng)基上（見表2），基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，30 g·L-1蔗糖，8 g·L-1瓊脂，pH 5.8，8周后統(tǒng)計分化結果。

1.3.2 探討暗培養(yǎng)時間對不定芽分化的影響

將草莓品種弗吉尼亞葉盤接種在最佳不定芽誘導培養(yǎng)基上，分別在黑暗條件下培養(yǎng)0、1、2、3周，然后取出放在正常光照條件下，8周后統(tǒng)計不定芽分化情況。

表2 不定芽誘導培養(yǎng)基中PGR組成Table2 Different concentration of PGRs in strawberry adventious shoots inducing (mg·L-1)

1.3.3 葉盤放置方式對不定芽分化的影響

將草莓品種弗吉尼亞葉盤分別按近軸面向下、向上兩種方式接種在不定芽分化培養(yǎng)基上，其他培養(yǎng)條件一致，8周后統(tǒng)計不定芽分化情況。

1.3.4 葉片幼嫩程度對不定芽分化的影響

在繼代30 d左右的草莓弗吉尼亞無菌試管苗上分別選取未完全展開的幼嫩葉片、剛剛展開的較幼嫩葉片、幼嫩程度中等的葉片及成熟葉片為試材，接種在不定芽誘導培養(yǎng)基上，其他培養(yǎng)條件一致，8周后統(tǒng)計不定芽分化情況。

1.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析方法

每組試驗分設3次重復。數(shù)據(jù)結果中標有不同字母表示數(shù)值α=0.05水平差異顯著。

再生頻率（%）=分化外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%；

葉盤平均再生芽數(shù)=不定芽總數(shù)/分化外植體數(shù)；

再生率（%）=分化葉盤數(shù)/接種葉盤數(shù)×100%。

1.4 草莓葉盤法轉化程序

將-70℃冰箱保存菌種在YEB固體培養(yǎng)基（加入40 mg·L-1利福平霉素、50 mg·L-1鏈霉素和100 mg·L-1卡那霉素）劃線培養(yǎng)后挑取單菌落或直接在4℃保存的平板上挑取單菌落，接于含有上述抗生素的液體YEB培養(yǎng)基中，28℃，200 r·min-1，振蕩培養(yǎng)24 h。取出菌液以1:10的接種量進行二次活化，當菌液濃度達OD600=0.5～0.6時，以5 000 r·min-1離心15 min，棄上清，用YEB重懸菌體，作為轉化用菌液；

取繼代30 d草莓無菌苗幼嫩葉片，用打孔器打成直徑4 mm的葉盤。

1.4.1 探討除菌劑對不定芽分化的影響

將草莓葉盤分別接種于含阿莫西林克拉維酸鉀（Amo）100 mg·L-1、頭孢唑啉鈉（Cef） 500 mg·L-1及不加抗生素的不定芽誘導培養(yǎng)基上培養(yǎng)，10 d繼代1次，8周后統(tǒng)計分化結果。每組試驗設3次重復，每次50個葉盤，分化數(shù)、再生率取3次結果平均值。

1.4.2 探討預培養(yǎng)時間對抗性芽分化的影響

將草莓葉盤接種在預培養(yǎng)培養(yǎng)基上，分別預培養(yǎng)0、1、2、3、4 d后進行侵染，然后進行除菌、繼代，10周后統(tǒng)計抗性芽分化情況。每組試驗設3次重復，每次500個葉盤，分化數(shù)，再生率取3次結果平均值。

1.4.3 探討侵染時間對抗性芽分化的影響

取預培養(yǎng)2 d葉盤，分別設5、7、10、15 min 4個侵染時間梯度，然后進行正常除菌、繼代，10周后統(tǒng)計抗性芽分化情況。每組試驗設3次重復，每次500個葉盤，分化數(shù)、再生率取3次結果平均值。

葉盤在除菌培養(yǎng)基上培養(yǎng)2周后，轉入含有20 mg·L-1卡那霉素的不定芽誘導培養(yǎng)基進行篩選培養(yǎng)，2周繼代1次。

待不定芽長至2 cm時，將其分單株從基部切下，接種到繼代擴繁培養(yǎng)基上擴繁后，每株系取一株轉入生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)。待再生小植株根系發(fā)達后，在培養(yǎng)室中將封口膜打開，在培養(yǎng)瓶中馴化7 d，洗凈根部培養(yǎng)基，然后移入松針、草炭、黑土比例為1∶2∶1的花盆中，遮光、保濕，逐漸降低濕度，增加光強直至正常栽培。

1.5 抗性植株PCR檢測

從抗性植株上取幼嫩葉片提取植物總DNA，應用Primer Premier 5.0軟件，設計t-PA基因特異性檢測引物，引物序列上游為P-1：5'CAGCGAG CCAAGGTGTTT 3'，下游為P-2：5'CGGTATGT TCTGCCCAAG 3'，PCR擴增產物為873 bp。PCR反應條件如下：94℃預變性7 min、94℃變性30 s、57℃退火30 s、72℃延伸1 min、72℃延伸10 min、4℃終止。

2 結果與分析

2.1 基因型對不定芽分化的影響

基因型對草莓不定芽分化起決定性作用。本研究所選用的弗吉尼亞、哈尼、森嘎拉和戈雷拉都是我國的主栽品種，各品種再生情況都有報道，但說法不一。研究表明，四種基因型草莓品種都有一定的再生能力，但差異顯著。由圖1、2可以看出，弗吉尼亞和森嘎拉兩個品種在不同PGR配比培養(yǎng)基上的再生頻率、葉盤平均再生芽數(shù)都遠遠高于哈尼和戈雷拉，再生頻率最高可達到75.8%和74.5%。本試驗中弗吉尼亞再生頻率較高，可以選其為草莓遺傳轉化的理想基因型。

研究結果表明，基因型不同，不定芽再生方式也不同。從不定芽再生形態(tài)觀察結果看，再生頻率高的兩個品種，其不定芽來源大部分是先產生愈傷，再由愈傷再生不定芽，小部分是由葉盤不經愈傷直接再生不定芽；而再生頻率低的品種，其分化的不定芽大多數(shù)不經愈傷，而直接來源于葉盤細胞脫分化，其影響機制還需進一步探討。

2.2 PGR配比對不定芽分化的影響

根據(jù)預實驗結果，設計5種PGR配比來確定草莓不定芽誘導的最佳PGR組合（見表1）。研究結果表明，弗吉尼亞品種在5號培養(yǎng)基上獲得最高再生頻率，而在TDZ為1.0 mg·L-1的培養(yǎng)基上再生能力顯著降低，生長素2，4-D 0.2 mg·L-1要好于IBA 0.2 mg·L-1，而2，4-D與IBA協(xié)同作用再生頻率達到最高（見圖1、2）。從芽分化的形態(tài)觀察結果來看，生長素選用2，4-D的組合，其不定芽分化大多數(shù)是先在葉盤周圍產生淡綠的愈傷，再由愈傷再生不定芽；生長素選用IBA的組合，其不定芽由葉盤不經愈傷直接再生的比較多。5號培養(yǎng)基不但再生頻率高，且不定芽分化狀態(tài)較好，畸形芽較少（見圖3）。

圖1 不同基因型、不同PGR配比對草莓再生頻率的影響Fig.1 Effect of different genotypes and PGRs concentrations in medium on strawberry shoot regeneration frequency

圖2 不同基因型、不同PGR配比對草莓分化效率的影響Fig.2 Effect of different genotypes and PGRs concentrations in medium on strawberry differentiation frequency

2.3 暗培養(yǎng)時間對草莓不定芽分化的影響

研究認為暗處理可減少外植體酚類物質的溢出，利于不定芽分化，此種說法已在許多植物上得以驗證[10]。但關于暗培養(yǎng)對草莓再生的影響，說法不一。從本研究結果可看出，暗培養(yǎng)對草莓品種弗吉尼亞的再生沒有明顯的促進作用，且暗培養(yǎng)時間超過2周，對不定芽分化有明顯抑制作用，暗培養(yǎng)1周能使再生頻率和分化效率都有所提高，但差異不顯著（見表3）。因此，從本研究結果看，暗培養(yǎng)對草莓品種弗吉尼亞再生不是必須的。

圖3 不同PGR配比對草莓品種弗吉尼亞植株再生的影響Fig.3 Effect of different PGRs concentrations in medium on strawberry cv.Fugilia regeneration

表3 暗培養(yǎng)時間對草莓葉盤不定芽分化的影響Table3 Effect of dark treatment on shoot regeneration from leaf discs of strawberry

2.4 葉盤放置方式對不定芽分化的影響

葉盤近軸面向下接種在培養(yǎng)基上時，膨大后其邊緣向上卷曲；當近軸面向上接種在培養(yǎng)基上時，則向下卷曲。Nehra等在研究草莓品種紅衣（Readcoat）再生時，發(fā)現(xiàn)葉盤近軸面接觸培養(yǎng)基時，其再生頻率還高于遠軸面接觸培養(yǎng)基[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，葉盤放置方式對草莓品種弗吉尼亞不定芽再生有顯著影響（見表4）。當葉盤近軸面向下放置時，其再生頻率達75%，葉盤平均再生芽數(shù)為4.7個；相反方向放置時，再生頻率低至13.3%，葉盤平均再生芽數(shù)降至1.4個。本研究還發(fā)現(xiàn)，放置方式不同，不定芽發(fā)生途徑也有顯著差異。近軸面向下時，葉盤邊緣再生大量愈傷組織，大部分不定芽來源于愈傷組織；近軸面向上放置時，葉盤邊緣愈傷組織產生少，不定芽大多數(shù)是不經愈傷直接由葉盤邊緣細胞脫分化而來的。

表4 葉盤放置方式對草莓葉盤不定芽分化的影響Table4 Effect of methods contacted with medium of leaf discsson shoot regeneration of strawberry

2.5 葉片幼嫩程度對草莓不定芽分化的影響

外植體幼嫩程度和生理狀態(tài)對大多數(shù)植物體再生效果都有直接影響。本研究結果表明隨著草莓葉片幼嫩程度的降低，其不定芽的分化能力也呈現(xiàn)明顯降低趨勢。由表5可知，較幼嫩葉片（葉片剛剛展開）再生頻率較高，為83.3%，而中等幼嫩程度的葉片（葉片剛剛完全展開2～3 d）和成熟葉片（葉片完全展開，且葉色深綠，外觀厚實）再生頻率則很低。對于還未展開的葉片（最為幼嫩的葉片）由于試驗時操作難度較大，且容易受到損傷而引起褐化，因此，我們在具體操作時，還是選取剛展開不久的幼嫩葉片為不定芽再生的外植體最為合適。

表5 葉片幼嫩程度對草莓葉盤不定芽分化的影響Table5 Effect of leaf discs age on shoot regeneration from leaf discs of strawberry

2.6 除菌劑對草莓葉盤不定芽分化的影響

在植物遺傳轉化過程中，除菌劑種類和濃度確定不但直接影響農桿菌能否有效去除，而且有些除菌劑對植株再生有一定抑制作用。

本研究選用兩種經本實驗室長期驗證除菌效果較好的除菌劑，來探討其對草莓葉盤不定芽分化的影響。研究結果表明（見表6），阿莫西林克拉維酸鉀在使用濃度范圍內對不定芽再生無顯著影響，而且再生頻率較對照高出4%，外植體分化狀態(tài)正常；而頭孢唑啉鈉在其使用濃度內對不定芽再生有明顯抑制作用，不定芽再生頻率較對照低24%，且有小量葉盤有褐化現(xiàn)象。因此，確定阿莫西林克拉維酸鉀為草莓遺傳轉化中使用的最佳除菌劑。

表6 不同除菌劑對草莓葉盤不定芽分化的影響Table6 Effect of different medicament concentration in medium on bud regeneration from leaf discs

2.7 預培養(yǎng)時間對抗性芽分化的影響

外植體在遺傳轉化前進行適當預培養(yǎng)（1～4 d），能改善細胞生理狀態(tài)，從而在一定程度上提高轉化效率，但預培養(yǎng)時間不宜過長。

本研究結果表明（見表7），對草莓品種弗吉尼亞來說，預培養(yǎng)2 d后侵染葉盤的不定芽再生率最高，可達3.6%，預培養(yǎng)1 d和未經預培養(yǎng)的不定芽分化率無顯著差異，分別為2.4%和2.6%，而預培養(yǎng)3 d時再生率則開始降低為2%，預培養(yǎng)4 d時分化率達到最低為1.2%。因此，本試驗中草莓品種弗吉尼亞葉盤轉化前最佳預培養(yǎng)時間確定為2 d。

2.8 侵染時間對抗性芽分化的影響

草莓遺傳轉化所選用的受體材料必須是幼嫩葉片，葉片較薄，操作不當，容易褐化而影響抗性芽分化。農桿菌侵染對葉盤傷害較大，因此在轉化時，需控制好農桿菌侵染時間。

本研究分別探討了侵染時間為5、7、10、15 min情況下抗性芽分化率。由表8可知，葉盤在菌液中浸泡5和7 min抗性芽分化率無顯著差異，分別為3%和3.6%；而浸泡10和15 min抗性芽分化率則明顯降低為1.4%和0.4%。因此，草莓品種弗吉尼亞葉盤侵染時間不宜過長，以5～7 min為最佳，超過7 min則明顯降低抗性芽分化率。

2.9 抗性植株PCR檢測

采用優(yōu)化的方法進行農桿菌LBA4404（pBET）、LBA4404（pBEMT）、LBA4404（pBFMT）對草莓品種弗吉尼亞葉盤大規(guī)模遺傳轉化（見圖4），獲得大量抗性植株。以質粒pUT為陽性對照，未轉化植株總DNA為陰性對照I，無菌水代替模板DNA為陰性對照II，分別以轉質粒pBET、pBEMT、pBFMT所獲得抗性植株總DNA為模板，t-PA基因特異性引物為檢測引物進行PCR檢測。由圖5～7可以看出，陽性對照質粒和陽性植株均擴增出873 bp片段，而兩個陰性對照均無擴增帶。

表7 預培養(yǎng)時間對草莓抗性芽分化的影響Table7 Effect of preculture time on resistance bud regenerationfrom leaf discs of strawberry

表8 侵染時間對草莓抗性芽分化的影響Table 8 Effect of infection time on resistance bud regeneration from strawberry

圖4 t-PA基因轉化草莓品種“弗吉尼亞”Fig.4 Transformation of strawberry cv.Fugilia with t-PA gene

圖5 轉質粒pBET抗性植株的PCR檢測Fig.5 PCR certificating result of resistance plants transferred with pBET

圖6 轉質粒pBEMT抗性植株的PCR檢測Fig.6 PCR certificating result of resistance plants transferred with pBEMT

圖7 轉質粒pBFMT抗性植株的PCR檢測Fig.7 PCR certificating result of resistance plants transferred with pBFMT

從pBET、pBEMT、pBFMT轉化植株中均擴增出t-PA基因片斷，可初步證明含pre、pro和marture的AFP基因已整合到草莓基因組DNA中。轉化效率為1.32%～3.78%（見表9）。

表9 質粒pBET、pBEMT、pBFMT轉化草莓弗吉尼亞PCR檢測結果和轉化效率Table9 PCR certificating result of resistance plants transferred with pBET、pBEMT、pBFMT

3 討 論

自Nehra等首次報道農桿菌介導法轉化草莓成功后，這一轉化體系便得到廣泛應用與發(fā)展。本研究選擇草莓主栽品種弗吉尼亞為轉化受體材料，首先結合文獻報道，建立草莓品種弗吉尼亞高效遺傳轉化體系，成功將t-PA基因轉化草莓。利用這一轉化系統(tǒng)，本實驗室已成功將核糖體失活蛋白基因及天花粉蛋白基因轉化草莓主栽品種森嘎拉和戈雷拉。

成功的遺傳轉化系統(tǒng)依賴于高頻再生受體系統(tǒng)，是直接影響基因轉化關鍵因素。在植物基因遺傳轉化中，首先是轉化效率較低，其次是遺傳轉化中農桿菌、抗生素的使用等會降低轉化外植體的再生頻率，因此受體系統(tǒng)的再生頻率對外源基因轉化率有直接影響。在組織培養(yǎng)中經常會發(fā)生體細胞無性系變異情況，這與組織培養(yǎng)方法、再生途徑及外植體基因型有關[12]。這些因素都會影響轉化材料的分化特性，在原來適合非轉化材料再生的條件下，有可能得不到較高的再生頻率。本研究通過對影響草莓葉片再生因素的探討，總結出影響草莓再生從而直接影響遺傳轉化效率的關鍵因素。

基因型是影響草莓離體再生的主要因子。本研究選用4種基因型，其中弗吉尼亞和森嘎拉再生能力較強，再生頻率都在70%以上，可作為遺傳轉化受體材料，而哈尼和戈雷拉再生頻率較低，不適宜遺傳轉化，或需對其再生條件進一步優(yōu)化。

TDZ的應用能顯著提高草莓葉盤再生能力。TDZ是一種棉花脫葉劑，自20世紀80年代初期被發(fā)現(xiàn)具有細胞分裂素活性后，廣泛用于植物組織培養(yǎng)，是木本植物組織培養(yǎng)中的一次革新。TDZ的這種促進效應與其高細胞分裂素活性、提高IAA活性和促進乙烯合成有關，但具體作用機理尚不清楚[13-14]。本研究在進行預試驗時，選用6-BA為細胞分裂素與生長素配合來誘導不定芽再生，但都因再生頻率太低而不能用于遺傳轉化。國內外學者都有用6-BA誘導不定芽成功的報道，原因是基因型、培養(yǎng)條件等不同或不適造成。目前誘導草莓再生大多數(shù)都使用TDZ，其再生效果要顯著高于6-BA，但是TDZ使用濃度超過2.0 mg·L-1時會產生較嚴重的玻璃化現(xiàn)象，且TDZ價格昂貴。6-BA與TDZ聯(lián)合使用，既可降低成本又可抑制玻璃化現(xiàn)象。

葉盤放置方式對再生頻率有顯著影響。大多數(shù)基因型草莓葉盤對放置方式較敏感，葉盤近軸面向下不定芽分化率遠遠高于相反方向放置。因此，在選擇草莓不同基因型進行再生試驗時，必須對其葉盤放置方式進行探討。

孫瑞芬等使用葉盤轉化法將美洲擬鰈抗凍蛋白基因遺傳轉化草莓品種星都2號和全明星，通過PCR檢測得到6個轉化株系，星都2號轉化效率為1.49%～1.67%，全明星為4.05%。與之相比，本試驗轉化效率基本在同一水平，達到1%～3%。

4 結論

試驗探討了影響草莓離體葉片不定芽誘導的主要因素，發(fā)現(xiàn)不同基因型草莓品種其再生頻率存在顯著差異。葉盤近軸面向下放置能顯著提高草莓品種弗吉尼亞再生頻率。建立了一個穩(wěn)定的草莓植株再生體系，確定草莓品種弗吉尼亞不定芽誘導的最佳培養(yǎng)基組分為：MS+TDZ 2 mg·L-1+IBA 0.1 mg·L-1+2,4-D 0.2 mg·L-1，pH 5.8。 并以此體系為基礎，以t-PA為目的基因，進行大規(guī)模遺傳轉化，獲得大量轉基因植株。

[1]雷家軍,代漢萍,譚昌華,等.中國草莓屬（Fragaria）植物的分類研究[J].園藝學報,2006,33(1):1-5.

[2]James D J,Passey A J,Barbera D J.Agrobacterium-mediated transformation of cultivated strawberry(Fragariaananassa Duch)using disarmed binary vectors[J].Plant Science,1990,69:79-94.

[3]Martinelli L,Rugini E,Saccardo F.Genetic transformation for biotic stress resistance in horticuhral plants[J].Vitro,2006，32(3):69-70.

[4]金萬梅,尹淑萍,魯韌強,等.GO基因對草莓遺傳轉化及抗病性鑒定[J].分子植物育種,2005,3(6):797-800.

[5]James D J,Passey A J,Esterbrook M A,et al.Progress in the introduction of transgenes for pest resistance in apples and strawberry[J].Phytoparasitica,1992,20(l):83-87.

[6]Nehra N S,Chibbar R N,Kartha K K,et al.Genetic transformation of strawberry by Agrobacterium tumefaciens using a leaf disk regeneration system[J].Plant Cell Rep,1990,9(6):293-298.

[7]張紅梅,王俊麗.“全明星”草莓葉片遺傳轉化體系的建立[J].生物技術,2005,15(3):68-70.

[8]朱海生,溫慶放,潘東明,等.反義乙烯受體FaEtr1和FaErs1基因對草莓的轉化[J].農業(yè)生物技術學報,2009(5):825-829.

[9]于冬梅,胡文玉,王關林.基因型和培養(yǎng)因子對誘導草莓葉片再生芽的影響[J].沈陽農業(yè)大學學報,1998,29(2):138-143.

[10]陳琴芳,戴良英,鄒學校.草莓高效離體再生體系的研究[J].湖南農業(yè)科學,2004(2):19-21.

[11]張利義,高遐虹,于同泉,等.草莓離體再生體系的研究[J].北京農學院學報,2004(2):5-7.

[12]袁維風,錢玉梅,徐德聰,等.影響草莓遺傳轉化率的因子及轉CBF1基因植株的獲得[J].江蘇農業(yè)學報,2009(5):1124-1128.

[13]Asao H,Shinmyo A,Nishizawa Y.Environmental risk evaluation of transgenic strawberry expressing a rice chitinase gene[J].Seibutsu-kogaku,2003,81:57-63.

[14]Nehra N S,Chibbar R N,Kartha K K,et al.Agrobacterium-mediated transformation of strawberry calli and recovery of transgenic plants[J].Plant Cell Rep,1990,9(1):10-17.