文景芝，楊曉敏，李櫻梅，孫劍萍

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.牡丹江煙草科學(xué)研究所，黑龍江 牡丹江 157011）

由丁香假單胞桿菌煙草致病變種[Pseudomonas syringae pv.tabaci（World et Foster）Young et al.]引起的煙草野火病屬暴發(fā)性、毀滅性細(xì)菌病害[1]，其發(fā)生嚴(yán)重影響煙草的品質(zhì)和產(chǎn)量。該病最早于1917年由美國(guó)人Wolf和Foster報(bào)道，1917～1918年野火病成為美國(guó)北卡州危害最嚴(yán)重的病害[2]。近年來，該病在我國(guó)云南、貴州、河南、山東、湖北、遼寧和吉林等省煙草種植區(qū)均大面積發(fā)生，并有逐年加重的趨勢(shì)。目前該病害在抗病育種方面雖然取得一些進(jìn)展，但研究表明中國(guó)推廣的烤煙品種長(zhǎng)脖黃、NC82、G140、G28、K326、紅花大金元等均不抗野火病[3]。目前生產(chǎn)上最常用的藥劑為農(nóng)用鏈霉素，雖對(duì)該病害防效較好，但連續(xù)使用不僅造成環(huán)境污染和殘留問題，對(duì)煙葉出口和卷煙安全帶來不利影響，而且使病原菌產(chǎn)生抗藥性，因此生物防治越來越受到人們的關(guān)注。當(dāng)前應(yīng)用較多的生防細(xì)菌主要有芽孢桿菌（Bacillus spp.）、假單胞桿菌（Pseudomonas spp.）、土壤放射桿菌（Agrobacterium radiobacter）以及其他一些細(xì)菌[4]。目前已篩選出對(duì)野火病菌有抑制作用的株系和對(duì)病菌有很高活性的放線菌類型C-25，A/60c-7/2和C-7/20，而且在美國(guó)放射形野桿菌（Radial field bacillus）菌系K84已進(jìn)入商品化應(yīng)用[5]。丁愛云等篩選出對(duì)野火病拮抗活性較強(qiáng)的菌株，其中細(xì)菌2株，放線菌2株，但國(guó)內(nèi)在野火病的生物防治方面仍停留在室內(nèi)試驗(yàn)階段，研究還不夠深入[6]。考慮到從煙葉中分離到細(xì)菌更容易定殖于煙葉中，因此本研究從不同品種的健康煙葉中分離大量細(xì)菌，從中篩選對(duì)野火病菌表現(xiàn)較強(qiáng)拮抗能力且抑菌效果穩(wěn)定的菌株，對(duì)其進(jìn)行16S rDNA鑒定，并進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化，測(cè)定發(fā)酵液的田間防效。為測(cè)定拮抗細(xì)菌在煙草葉片中的定殖能力，本研究對(duì)拮抗細(xì)菌進(jìn)行利福平抗性誘導(dǎo)試驗(yàn)，為生物農(nóng)藥的開發(fā)和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株及培養(yǎng)基

煙草野火病菌（Pseudomonas syringae pv.tabaci）由牡丹江煙草科學(xué)研究所提供。

細(xì)菌的分離培養(yǎng)采用NA培養(yǎng)基；細(xì)菌的發(fā)酵培養(yǎng)采用NB培養(yǎng)液；細(xì)菌的保存采用PDA培養(yǎng)基。培養(yǎng)基配方參照文獻(xiàn)[7]。

1.2 煙草葉片的采集與細(xì)菌的分離

從牡丹江煙草科學(xué)研究所試驗(yàn)田采集不同品種健康煙葉30份，分別取2 g葉片研磨，采用平板稀釋分離法分離葉片內(nèi)外的細(xì)菌[8]。挑取不同類型單菌落在NA平板上劃線純化培養(yǎng)，將單菌落轉(zhuǎn)接到PDA斜面上編號(hào)培養(yǎng)后，保存待用。

1.3 煙草野火病菌拮抗細(xì)菌的篩選

拮抗細(xì)菌的篩選：將混有5%病原菌發(fā)酵液的培養(yǎng)基冷卻成平板。吸取70 μL待測(cè)細(xì)菌菌懸液在平板上劃線[9]，以無菌培養(yǎng)液劃線為對(duì)照，28℃培養(yǎng)2～3 d后觀察抑菌效果，測(cè)量抑菌帶寬度。對(duì)于有抑菌效果的進(jìn)行皿內(nèi)復(fù)篩，檢測(cè)其遺傳穩(wěn)定性，方法同上。

拮抗細(xì)菌的純培養(yǎng)[10]：把稀釋10-5倍的菌液涂布于牛肉膏固體培養(yǎng)基平板，培養(yǎng)一段時(shí)間后形成單菌落。挑選長(zhǎng)勢(shì)好、菌落飽滿的菌株用連續(xù)劃線法對(duì)細(xì)菌純化培養(yǎng)，保存待用。

1.4 拮抗細(xì)菌菌株的鑒定

拮抗菌株的形態(tài)觀察及生理生化特性鑒定，參照文獻(xiàn)[11]。

拮抗菌株的16S rDNA鑒定：采用Schroth等的方法提取拮抗細(xì)菌菌株總DNA[12]，并稍作改進(jìn)。采用細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)通用引物對(duì)F338GC和R518（引物由上海生工合成）進(jìn)行PCR。PCR反應(yīng)體系：dNTP（10 mmol·L-1）0.5 μL，10×buffer（含 MgCl2）5 μL，引物 F338GC 和 R518（25 μmol·L-1）各 1 μL，TaqDNA 酶 1 μL，模板 2 μL（200 ng·μL-1），無菌去離子水39.5 μL。PCR擴(kuò)增條件：95℃ 5 min，94℃ 10 s，62℃ 20 s，66℃40 s，68℃ 7 min，35個(gè)循環(huán)。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，將PCR產(chǎn)物交上海生工測(cè)序，將測(cè)得的16S rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫序列進(jìn)行BLAST分析比對(duì)，確定拮抗細(xì)菌菌株的分類地位。

1.5 拮抗細(xì)菌菌株的利福平抗性標(biāo)記

參照杜立新等的方法并稍加改進(jìn)[13]。首先在NA平板上活化拮抗細(xì)菌菌株，挑取單菌落在含有利福平5 μg·mL-1的NB培養(yǎng)基中28℃下震蕩培養(yǎng)2 d，然后在含有5 μg·mL-1利福平的NA平板上培養(yǎng)，待長(zhǎng)出菌落后，逐級(jí)提高利福平濃度進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，使菌株逐漸適應(yīng)高濃度利福平。用NA平板拮抗試驗(yàn)驗(yàn)證抗藥菌株對(duì)煙草野火病菌的拮抗性，以原始菌株為對(duì)照。

1.6 拮抗細(xì)菌發(fā)酵條件的優(yōu)化

1.6.1 發(fā)酵液中拮抗細(xì)菌活菌數(shù)與菌液吸光度的相關(guān)性測(cè)定

將拮抗細(xì)菌菌懸液用無菌水稀釋成10-4、10-5、10-6、10-7四個(gè)濃度，采用UV-8000紫外分光光度計(jì)測(cè)定各濃度菌懸液OD625值，同時(shí)在NA平板上加入各濃度菌懸液100 μL，用涂布器涂勻，28℃下培養(yǎng)2 d，計(jì)測(cè)各濃度菌懸液的菌落數(shù)，計(jì)算單位體積活菌數(shù)和吸光值與活菌數(shù)的相關(guān)性。

1.6.2 單因子試驗(yàn)

在發(fā)酵條件初篩的基礎(chǔ)上，選取不同單一碳源（可溶性淀粉、葡萄糖、木糖、麥芽糖、甘油、乳糖、蔗糖和甘露醇，用量0.5%）；在碳源不變情況下，選取不同單一有機(jī)氮源（牛肉膏、蛋白胨、酵母膏和胰蛋白胨，用量1%）和不同單一無機(jī)氮源（NH4NO3、（NH4）2SO4、NH4Cl和KNO3，用量1%），并進(jìn)行兩種較優(yōu)有機(jī)氮源的組合配比試驗(yàn)；在較優(yōu)碳源、氮源情況下，加入不同量的NaCl（0.1%、0.3%和0.5%）；較優(yōu)碳源、氮源和NaCl中，加入不同量的無機(jī)氮源（0.1%、0.3%和0.5%）。測(cè)定各條件下菌懸液OD625值及其對(duì)煙草野火病菌的抑菌活性。

1.6.3 培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗(yàn)

依據(jù)單因子試驗(yàn)結(jié)果，選取較優(yōu)不同碳源濃度（0.1%、0.3%和0.5%）、較優(yōu)不同有機(jī)氮源濃度（0.5%、1%和2.0%）、較優(yōu)無機(jī)不同氮源濃度（0.1%、0.3%和0.5%）、不同NaCl濃度（0.1%、0.3%和0.5%），進(jìn)行4因素3水平的正交試驗(yàn)，28℃下震蕩培養(yǎng)2～3 d。測(cè)定各條件下菌懸液OD625值及其對(duì)煙草野火病菌的抑菌活性。

1.6.4 培養(yǎng)條件的優(yōu)化試驗(yàn)

采用優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基，在不同培養(yǎng)溫度（25、28、33、36和39℃）、不同培養(yǎng)基pH（4.0、4.5、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和9.0）、不同接種量（1%、2%、3%、4%、5%、8%和10%）和不同通氣量（250 mL三角瓶中分別裝20、30、40、50、60、70和80 mL）條件下培養(yǎng)拮抗細(xì)菌菌株，28℃培養(yǎng)2～3 d后，測(cè)定各條件下菌懸液OD625值及其對(duì)煙草野火病菌的抑菌活性。

1.7 拮抗細(xì)菌發(fā)酵液的田間藥效試驗(yàn)

本試驗(yàn)于2010年6～7月在牡丹江煙草科學(xué)研究所試驗(yàn)場(chǎng)煙田進(jìn)行，每小區(qū)有團(tuán)棵期煙株15株。共設(shè)3個(gè)處理：A-拮抗菌活菌發(fā)酵液（6倍稀釋液，約6×108cfu·mL-1）；B-拮抗菌優(yōu)化發(fā)酵液（6倍稀釋液，約6×108cfu·mL-1）；C-藥劑甜葉桔（3 000倍稀釋液）；D-清水對(duì)照。采用隨機(jī)區(qū)組排列，重復(fù)3次。采用高壓噴霧法噴霧（每處理噴施2 L），隔天重新噴1次。2 d后各處理噴施病原菌，每處理噴施2 L。噴施病原菌后保濕，第5天、第10天按照中華人民共和國(guó)煙草病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（YC T 39-1996）[3]分別調(diào)查，每小區(qū)調(diào)查10株，每株調(diào)查中下部葉片10片，計(jì)算病情指數(shù)及防治效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草野火病菌拮抗細(xì)菌的篩選

從健康煙草成熟葉片中分離到細(xì)菌287株，其中14株對(duì)煙草野火病菌具有一定拮抗作用，抑菌帶寬度在3.6～9.3 mm之間。其中菌株Y32的抑菌效果最好，并且抑菌效果穩(wěn)定（見圖1-A），至少達(dá)10代左右。

2.2 菌株Y32的鑒定

菌株Y32的形態(tài)特征觀察結(jié)果表明，菌株Y32在NA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，菌落形態(tài)為圓形或近圓形，突起，乳白色，不透明，不產(chǎn)生色素。其生理生化特性為：運(yùn)動(dòng)性試驗(yàn)、葡萄糖氧化發(fā)酵、M.R.試驗(yàn)、V.P.試驗(yàn)、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)以及明膠液化試驗(yàn)均為陽性，且NaCl含量為2%、5%、7%、10%時(shí)菌株生長(zhǎng)良好，吲哚試驗(yàn)為陰性。上述特性與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）完全一致，初步確定該菌株為枯草芽孢桿菌。

菌株Y32 16S rDNA測(cè)序結(jié)果如下：GCTATGC AATACTTACCTGCAATAGTGACGAAAGTCTGGAC GGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGG ATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTA CCGTTCGAATAGGGCGGTGCCTTGACGGTACCTAA CCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCC GCGGTAATAAAAA。此序列與GenBank中已報(bào)道的序列同源性比較結(jié)果表明，Y32與枯草芽孢桿菌 MSB10（Bacillus subtilis MSB10）的同源性達(dá)到96%，證明該菌屬于枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

2.3 拮抗細(xì)菌Y32的利福平抗性標(biāo)記

試驗(yàn)最終培養(yǎng)出抗80 μg·mL-1利福平的標(biāo)記菌株，記為Y32標(biāo)記。該標(biāo)記菌株對(duì)煙草野火病菌的拮抗作用如圖1-D所示，表明Y32標(biāo)記菌株對(duì)煙草野火病菌的拮抗效果顯著低于原始菌株，而且在培養(yǎng)過程中出現(xiàn)拮抗細(xì)菌生活力下降、拮抗活性降低、菌體變透明等現(xiàn)象，與原始菌株不同，而且無法計(jì)數(shù)，因此不能作為進(jìn)一步研究拮抗細(xì)菌在煙草植株體內(nèi)定殖試驗(yàn)的材料。

2.4 拮抗細(xì)菌發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.4.1 發(fā)酵液中拮抗細(xì)菌的活菌數(shù)與菌液吸光度的相關(guān)性

發(fā)酵液中拮抗細(xì)菌的活菌數(shù)量與其OD625值呈線性關(guān)系，線性方程為y=1.4541x+6.4316，r2=0.9393，因此可以用發(fā)酵液的OD625值代表發(fā)酵液中的拮抗細(xì)菌活菌數(shù)。以下試驗(yàn)均用發(fā)酵液的OD625值來表示發(fā)酵液中的拮抗細(xì)菌活菌數(shù)。

2.4.2 單因子試驗(yàn)

試驗(yàn)結(jié)果表明，最佳碳源為葡萄糖，最適濃度為0.1%；單一氮源以蛋白胨和酵母膏為宜，其中0.5%酵母膏+0.3%蛋白胨的配比抑菌效果最好，且組合濃度為1%時(shí)拮抗細(xì)菌的產(chǎn)量最大，且抑菌帶最寬；無機(jī)氮源以0.5%KNO3最好；一定量的NaCl能促進(jìn)拮抗細(xì)菌的生長(zhǎng)，并能提高拮抗細(xì)菌的抑菌活性，其中以0.3%NaCl效果最好。

2.4.3 培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗(yàn)

以抑菌帶寬為指標(biāo)，得出拮抗細(xì)菌的實(shí)驗(yàn)室最佳發(fā)酵配方為：氮源（酵母膏∶蛋白胨=5∶3）1%，葡萄糖0.1%，NaCl 0.3%，KNO30.5%。通過培養(yǎng)條件優(yōu)化試驗(yàn)，結(jié)果得到抑菌帶寬度達(dá)到16.8 mm（見圖1-B），大于正交試驗(yàn)結(jié)果中的最高值11.4mm。

圖1 菌株Y32對(duì)煙草野火病菌的拮抗效果Fig.1 Effect of Y32 against Pseudomonas syringae pv.tabaci

2.4.4 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

試驗(yàn)結(jié)果顯示，使拮抗細(xì)菌的生長(zhǎng)量最大、且抑菌帶最寬的培養(yǎng)條件為：溫度28℃、pH 7.0～7.5、接種量4%、裝液量250 mL三角瓶裝50 mL。

2.5 Y32發(fā)酵液對(duì)煙草野火病的田間藥效

試驗(yàn)結(jié)果見表1。Y32菌株優(yōu)化發(fā)酵前防效為60.7%，顯著好于藥劑甜葉桔的防效45.3%，優(yōu)化發(fā)酵后的防效為71.6%，比優(yōu)化發(fā)酵前提高了10.9%，顯著高于其他處理。

表1 Y32發(fā)酵液對(duì)煙草野火病的田間藥效Table1 Field effect of Y32 fermentation liquid against tobacco wildfire disease

3 討論與結(jié)論

拮抗菌篩選方法中，最常用的有平板劃線法、抑菌圈法和瓊脂塊法[8]。由于本試驗(yàn)中病原菌和所篩選的拮抗菌均為細(xì)菌，在以上方法的基礎(chǔ)上，將病原菌與待測(cè)細(xì)菌均制成菌懸液再進(jìn)行拮抗性鑒定，這種方法觀察結(jié)果更加直觀、快速。由于細(xì)菌在離體條件下拮抗作用與自然環(huán)境下防病作用往往不存在必然聯(lián)系，因此本試驗(yàn)又將篩選出的拮抗效果較好的Y32菌株進(jìn)行田間試驗(yàn)，防效較多。

細(xì)菌是目前人們研究的一類重要生防菌，能夠產(chǎn)生細(xì)菌素、抗生素及次生代謝產(chǎn)物等活性物質(zhì)，對(duì)病原菌具有很強(qiáng)的抑制作用，具有廣泛的用途和巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。已開發(fā)出大量?jī)?yōu)良生防菌株進(jìn)行商品化應(yīng)用，取得了可觀的生態(tài)效益[14]。本試驗(yàn)篩選出的枯草芽孢桿菌Y32對(duì)煙草野火病菌具有很強(qiáng)的拮抗作用。通過發(fā)酵條件優(yōu)化和培養(yǎng)基成分正交試驗(yàn)，明確其最佳的發(fā)酵配方為：氮源1%（酵母膏∶蛋白胨=5∶3），葡萄糖0.1%，NaCl 0.3%，KNO30.5%；最佳培養(yǎng)條件為：發(fā)酵溫度28℃，培養(yǎng)基pH 7.0～7.5，接種量4%，裝液量250 mL三角瓶裝液50 mL。其最佳發(fā)酵條件的確定，為以后活性物質(zhì)的進(jìn)一步研究和生物農(nóng)藥的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

拮抗細(xì)菌能否在目標(biāo)植株內(nèi)定殖是生防菌取得防效的關(guān)鍵[14]，研究拮抗細(xì)菌在植株體內(nèi)定殖的方法主要有抗利福平、氨芐青霉素和卡那霉素等抗菌素標(biāo)記法及電鏡觀察法、抗血清法和免疫膠體金染色法等[15]。本試驗(yàn)雖然獲得了利福平抗性標(biāo)記菌株，但由于該標(biāo)記菌株對(duì)煙草野火病菌的抑制作用顯著低于野生菌株，并且在培養(yǎng)基上菌落呈透明狀，已經(jīng)不能代表原來的野生菌株，因此認(rèn)為利福平抗性標(biāo)記不適于研究拮抗細(xì)菌在煙草葉片中的定殖能力，其他標(biāo)記方法有待研究，如綠色熒光蛋白標(biāo)記方法，本研究將針對(duì)此方法進(jìn)一步進(jìn)行該生防菌的定殖研究。

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