謝 瓊，辛冰牧，王 景，呂志堂，王 靜，吳元亮

（1中國航天員科研訓(xùn)練中心，北京100094；2河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院河北省微生物多樣性研究與應(yīng)用實(shí)驗(yàn)室，保定071002）

1 引言

如同在地球上一樣，微生物在飛船上是廣泛存在的。俄羅斯載人航天的經(jīng)驗(yàn)證明隨著飛行時(shí)間的延長，飛船中微生物的危害會越來越嚴(yán)重[1-3]。在太空中微生物的危害對人體而言主要是影響乘組健康，作為病原體引起感染、過敏[4]；同時(shí)微生物能釋放有害氣體，成為間接的致病源；對飛船系統(tǒng)而言，一些生物降解類微生物能夠降解飛船材料、腐蝕儀器儀表，影響飛船硬件設(shè)備穩(wěn)定性致使儀器及系統(tǒng)失靈等[5]。因此微生物快速鑒定技術(shù)對于評估飛船環(huán)境意義重大。

目前，國際空間站主要使用傳統(tǒng)培養(yǎng)法在軌進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，而更細(xì)致的分類鑒定受到座艙條件的限制只能在地面進(jìn)行。多年來NASA一直在尋求在軌免培養(yǎng)微生物快速鑒定方法[6]。一方面免培養(yǎng)法較培養(yǎng)法能快速、準(zhǔn)確、靈敏地反映環(huán)境中微生物的多樣性，在微生物檢測和多樣性研究研究中得到了廣泛的應(yīng)用[7]；另一方面，培養(yǎng)法可能會低估微生物種群的數(shù)量，因?yàn)槟承┪⑸锞哂蟹桥囵B(yǎng)存活能力，或需要特殊培養(yǎng)條件[8，9]。盡管如此，免培養(yǎng)法在空氣微生物多樣性研究領(lǐng)域尚未得到廣泛應(yīng)用，其主要原因在于沒有有效的適于免培養(yǎng)應(yīng)用的空氣微生物采樣及元基因組DNA提取方法。

本文優(yōu)化了微孔濾膜采集空氣微生物條件，建立了元基因組DNA快速提取方法，并通過革蘭氏陰性菌-大腸桿菌和革蘭氏陽性菌-金黃色葡萄球菌驗(yàn)證，所得DNA滿足PCR擴(kuò)增需要，為空氣微生物免培養(yǎng)快速鑒定奠定了基礎(chǔ)。

2 材料和方法

2.1 材料

2.1.1 菌種

大腸桿菌（Escherichiacoli）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus），兩者均為實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。

2.1.2 儀器

生物安全柜（BHC-1300IIA2）、臺式高速冷凍離心機(jī)（CT14RD）、循環(huán)水多用真空泵（SHB-3，10L/min）、溫度梯度PCR儀、智能蒸汽滅菌器（VPLA5032）、過濾式空氣采樣器、微孔濾膜（0.22μm 和0.45μm）。

2.1.3 試劑

TE（100mmol/L Tris.Cl，10mmol/L EDTA，pH8.0）、試劑盒1：土壤基因組DNA快速提取試劑盒（離心柱型）、試劑盒2：超純土壤基因組DNA提取試劑盒、試劑盒3：細(xì)菌、真菌DNA快速提取試劑盒、DNA快速提取液（1%Triton X-100，0.5%Tween 20，10mM Tris·Cl（pH 8.0））、PCR擴(kuò)增體系（2.5U/μL Taq DNA Polymerase、10×Taq Buffer、2.5mmol/L dNTPs、去離子雙蒸水、20μmol/L引物）、溶葡萄球菌酶。

2.2 方法

2.2.1 空氣樣品元基因組DNA提取方法

（1）樣品制備

采用摻菌法，以確保樣品中含有一定數(shù)量的微生物。具體方法如下：抽濾250L空氣，將先其中的懸浮物采集在0.22μm微孔濾膜上，用1mL TE緩沖液洗脫濾膜上采集的樣品，121℃滅菌30min后加入1.3×107cfu的大腸桿菌和2.7×107cfu的金黃色葡萄球菌，10000rpm離心5min，棄上清，沉淀用于DNA提取。

（2）元基因組DNA提取

采用試劑盒1、試劑盒2、試劑盒3（提取方法參照說明書）和DNA快速提取液進(jìn)行DNA提取。DNA快速提取液提取方法為：在樣品中加入300μL的提取液，100℃煮沸5min，10000rpm離心5min，得上清為元基因組DNA，用0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

（3）元基因組DNA檢驗(yàn)

得到的元基因組DNA采用紫外分光光度計(jì)測定OD260nm，計(jì)算得DNA得率，并分別用大腸桿菌特異引物 （Alr1:5’-CTGGAAGAGGCTAGCCTGGACGAG-3’和 Alr2:5’-AAAATCGGCACC GGTGGAGCGATC-3’）[10]和金黃色葡萄球菌特異引物（nucF:5'-GCGATTGAT GGTGATACGGTI-3'和nucR:5'-AGCCAAGCCTT GACGAACTAAAGC-3'）[11]進(jìn) 行PCR擴(kuò)增，進(jìn)一步比較不同實(shí)驗(yàn)方法提取DNA的效果。

2.2.2 空氣樣品采集方法

將過濾式空氣采樣器通過真空膠管鏈接于SHB-3循環(huán)水多用真空抽氣泵（抽氣量10L/min），根據(jù)濾膜孔徑和抽濾時(shí)間設(shè)計(jì)如下采集方案（表1）：

表1 空氣樣品采集條件的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

樣品采集結(jié)束后，用TE緩沖液將采集物從微孔濾膜上洗脫下來，然后用1.2.1.2確定的方法提取元基因組DNA，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，并采用細(xì)菌16S rDNA 通用引物 27F（5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’）和 1525R（5’-AGAAAGGAGGTGWTCCARCC-3’）[12]進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢驗(yàn)提取DNA的質(zhì)量。25μl擴(kuò)增體系中加1μl DNA模板，2U Taq DNA聚合酶，其它為常規(guī)用量。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性4min，95℃變性 45s，55℃退火 90s，72℃延伸 1min，72℃后延伸5min，30循環(huán)。擴(kuò)增結(jié)束后，0.7%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

3 結(jié)果

3.1 樣品DNA提取方法的確定

根據(jù)OD260nm測定結(jié)果計(jì)算得到的采用摻菌法各方法提取DNA的得率見表2，結(jié)果表明：試劑盒1 DNA提取得率最高，且重現(xiàn)性好，試劑盒2和快速DNA提取液DNA得率明顯低于試劑盒1，而試劑盒3 DNA得率最低。根據(jù)元基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果（圖1）：各方法提取得到的DNA分子量都在20kb以上，調(diào)帶較為整齊。

表2 不同方法提取樣品元基因組DNA的得率比較

采用所提的元基因組DNA進(jìn)行大腸桿菌和金黃色葡萄球菌特異引物擴(kuò)增的結(jié)果如圖2所示。

圖1 不同方法提取樣品元基因組結(jié)果比較

圖2 大腸桿菌和金黃色葡萄球菌特異引物擴(kuò)增不同方法提取的DNA檢測結(jié)果

總體來看，除試劑盒3外，其它三種方法得到的DNA都得到了大腸桿菌的特異擴(kuò)增產(chǎn)物片段（約370bp），且試劑盒1提取得到的DNA的擴(kuò)增效果最好；雖然試劑盒1、試劑盒2提取的DNA樣品得到了金黃色葡萄球菌特異擴(kuò)增片段（約290bp），但是擴(kuò)增效果較差。說明即使是試劑盒1，對金黃色葡萄球菌DNA的提取效果也較差。因此，以效果最好的試劑盒1提取法為基礎(chǔ)，對實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行了如下改進(jìn)：

（1）在第2步37℃水浴時(shí)加入12U的溶葡萄球菌酶，并將水浴時(shí)間和第3步65℃水浴時(shí)間延長到30min～60min。

（2）將使用說明中第9步改為：加入二倍體積的冰乙醇，充分混勻，10000rpm離心10min，小心倒掉上層懸液；加入適量體積的70%乙醇，輕輕彈離心管的底部使DNA懸浮后，10000rpm離心10min，棄乙醇，晾干；最后用30μl洗脫緩沖液EB溶解沉淀即可。

實(shí)驗(yàn)方法改進(jìn)前后DNA特異引物擴(kuò)增結(jié)果比較見圖3，顯然改進(jìn)提取方法后大腸桿菌和金黃色葡萄球菌特異擴(kuò)增效率均有所提高，尤其是金黃色葡萄球菌的擴(kuò)增效率改善明顯。

圖3 DNA提取方法改進(jìn)前后特異引物擴(kuò)增效果對比

3.2 不同采樣方法效果的比較

上述結(jié)果說明改進(jìn)的提取方法對革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌都適用，因此以改進(jìn)的試劑盒1提取方法為標(biāo)準(zhǔn)，評價(jià)不同采樣方法所得樣品是否滿足元基因組DNA提取及PCR擴(kuò)增要求。檢測結(jié)果如圖4所示：

圖4 不同條件采樣后提取的DNA PCR擴(kuò)增檢測結(jié)果

結(jié)果顯示：用兩種孔徑的微孔濾膜采集30min所得樣品均不能提取得到滿足普通PCR檢測所需的DNA；而用兩種孔徑的微孔濾膜采集45min和60min所得樣品均可提取得到滿足普通PCR要求的DNA，但總體上0.22μm微孔濾膜采集所得樣品提取DNA后擴(kuò)增效果要比0.45μm微孔濾膜好，并且采集時(shí)間在60min時(shí)所得DNA擴(kuò)增效率最高。說明采集30min時(shí)所得樣品中微生物數(shù)量太少，尚不足以提取得到滿足普通PCR檢測的DNA，采集45min時(shí)所得樣品中微生物數(shù)量雖已可提取得到滿足普通PCR檢測靈敏度要求量的DNA。但若適當(dāng)延長采樣時(shí)間，增加采集的空氣體積，則對于分析空氣中低豐度的微生物更合適些。

4 討論

目前空氣微生物樣品采集多采用撞擊法或自然沉降法，這兩種方法均以培養(yǎng)為基礎(chǔ)檢測微生物[13]。在飛船上，環(huán)境微生物檢測需快速、敏感，而傳統(tǒng)的培養(yǎng)法無法滿足此要求。免培養(yǎng)法能達(dá)到快速、高效、準(zhǔn)確檢測微生物的目的，已成為研究各類環(huán)境微生物多樣性的重要方法，但是在空氣微生物多樣性研究領(lǐng)域尚未得到廣泛應(yīng)用，其主要原因在于沒有有效的適于免培養(yǎng)應(yīng)用的空氣微生物采樣及元基因組DNA提取方法[14-16]。

本研究發(fā)現(xiàn)與其他試劑比較，試劑盒1對于元基因組DNA的提取效率最高。對提取液的組成、原理和方法進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)快速提取液法通過煮沸去除核酸內(nèi)切酶，但有資料顯示，有一些菌株含有的核酸內(nèi)切酶靠煮沸是無法完全去除的，如含有endA+基因型的菌株；此外，試劑盒2和試劑盒3所采用的方法在細(xì)胞破壁后，DNA與核酸內(nèi)切酶仍有充分接觸時(shí)間，DNA有可能被降解；而離心柱分離通過吸附、快速漂洗和離心，減小了核酸內(nèi)切酶與DNA作用的面積和時(shí)間，并能有效的去除細(xì)胞代謝產(chǎn)物、蛋白等雜質(zhì)，最后所得到的洗脫的基因組DNA純度較高。

使用提取模板擴(kuò)增特異片段時(shí)發(fā)現(xiàn)即使是試劑盒1，對金黃色葡萄球菌DNA的擴(kuò)增效果也較差。這可能與革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)影響提取效果有關(guān)。因此在改進(jìn)方法中，加入了溶葡萄球菌酶和二倍體積的冰乙醇促進(jìn)細(xì)菌壁的裂解，至此，改進(jìn)的提取方法對革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌均適用。

本研究建立了可用于免培養(yǎng)研究的室內(nèi)空氣微生物采集及DNA提取方法，所得DNA樣品滿足普通PCR檢測需要，為空氣樣品微生物的免培養(yǎng)研究奠定了方法學(xué)基礎(chǔ)。 ◇

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