毛 澤 仁, 張 景, 金 鳳 燮, 魚 紅 閃

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連 116034; 2.大連市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所, 遼寧 大連 116021 )

0 引 言

絞股藍(lán)中含有多種化學(xué)成分[1-2],其中以絞股藍(lán)皂苷為主要的藥理活性成分。絞股藍(lán)皂苷(Gypenosides)是絞股藍(lán)全草的有效成分,具有多種醫(yī)療保健功能[3]。自然界中絞股藍(lán)皂苷多是由絞股藍(lán)皂苷元與葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、木糖及阿拉伯糖等糖基連接而成,這種結(jié)構(gòu)不是其生物活性的最佳狀態(tài),若將其轉(zhuǎn)化為低糖基皂苷或皂苷元,它的生物活性有可能會(huì)得到提高。

本實(shí)驗(yàn)室前期篩選出的Absidiasp. GYP4r菌,能夠產(chǎn)生一種可將絞股藍(lán)皂苷水解為低糖基絞股藍(lán)皂苷的酶[4],該酶有可能提高絞股藍(lán)皂苷的生物活性。本實(shí)驗(yàn)對(duì)絞股藍(lán)皂苷糖苷酶的分離純化及性質(zhì)進(jìn)行了研究,為今后絞股藍(lán)皂苷糖苷酶的分子生物學(xué)性質(zhì)進(jìn)一步研究提供了一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

實(shí)驗(yàn)菌種Absidiasp.GYP4r,由大連工業(yè)大學(xué)菌種保藏所提供；絞股藍(lán)皂苷；人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品，實(shí)驗(yàn)室自制；薄層層析板,德國Merk公司提供。

1.2 方 法

1.2.1 培養(yǎng)基的制備

斜面培養(yǎng)基的制備:準(zhǔn)確稱取硝酸鈉3.0 g,磷酸二氫鈉1.0 g,七水合硫酸鎂0.5 g,氯化鉀0.5 g,硫酸鉀0.5 g,硫酸亞鐵0.01 g,蔗糖30.0 g,瓊脂15 g,用去離子水定容至1 000 mL,121 ℃濕熱滅菌后備用。

擴(kuò)大培養(yǎng)基的制備:稱取麥麩16.0 g,槐花4.0 g(作為誘導(dǎo)物),溶于20 mL去離子水中,121 ℃ 濕熱滅菌后待用。

1.2.2 菌種的培養(yǎng)及粗酶液的提取

將菌種接種于已滅菌的斜面培養(yǎng)基中,在30 ℃的恒溫箱中培養(yǎng)6～7 d,活化后的菌放于冰箱內(nèi)保存。將斜面菌種接種于已滅菌的擴(kuò)大培養(yǎng)基中,仍在30 ℃的恒溫箱中培養(yǎng)6～7 d。待菌長好后將培養(yǎng)基浸泡于100 mL 0.02 mol/L pH 5.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液中2 h,邊浸泡邊攪拌,然后將浸泡液過濾。濾液用高速冷凍離心機(jī)在8 000 r/min下離心15 min,收集上清液,在磁力攪拌的條件下,緩慢加入已研磨好的硫酸銨粉末至75%飽和度,4 ℃下靜置1～2 h。再用高速冷凍離心機(jī)在13 000 r/min下離心20 min,棄上清,收集蛋白質(zhì)沉淀。沉淀用10 mL 0.02 mol/L pH 5.0 醋酸-醋酸鈉緩沖液溶解,裝入透析袋,用相同的緩沖液透析24 h,約每2 h 更換一次緩沖液。透析結(jié)束后,用高速冷凍離心機(jī)在13 000 r/min下離心10 min,除去不溶性雜蛋白。所得上清液即為粗酶液,將酶液放于冰箱中保存。

1.2.3 酶活力的測(cè)定

取1 mg絞股藍(lán)皂苷,加0.2 mL 95%的乙醇和0.8 mL的0.02 mol/L pH 5.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液將其溶解,配制成底物,取0.1 mL的底物與0.1 mL的酶液混合,40 ℃下反應(yīng)24 h,然后加入0.2 mL水飽和正丁醇終止反應(yīng),振蕩分層后取上層作薄層層析(TLC)分析。展開劑V(氯仿)∶V(甲醇)∶V(水)=7∶3∶0.5；顯色劑為10%的濃硫酸。

1.2.4 粗酶液的純化

用0.5 mol/L的NaOH和0.5 mol/L的HCl反復(fù)處理DEAE-cellulose DE52陰離子交換柱,再用0.02 mol/L pH 5.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液平衡后,向柱子中加入8 mL酶液,然后用60、90、120、180、240、300、400、500、600 mmol/L的KCl梯度洗脫,自動(dòng)部分收集器以3 min/管的速度收集洗脫液,洗脫液經(jīng)紫外檢測(cè)儀在280 nm 下跟蹤測(cè)定各點(diǎn)的OD值,并通過蛋白質(zhì)色譜儀繪出吸收?qǐng)D譜。收集各峰值管的酶液,TLC檢測(cè)酶活力。

1.2.5 酶的分子質(zhì)量測(cè)定

將純化后的酶溶液經(jīng)三氯乙酸沉淀,丙酮洗滌后,再用醋酸-醋酸鈉緩沖液和上樣緩沖液溶解,然后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳,最終得到單一的條帶。以已知分子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白為參照,根據(jù)蛋白質(zhì)的遷移率與其分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)的關(guān)系繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線,確定純化后酶的分子質(zhì)量。

1.2.6 酶學(xué)特性的研究

采用絞股藍(lán)皂苷糖苷酶的酶活力測(cè)定方法,對(duì)酶反應(yīng)的條件進(jìn)行研究,確定酶反應(yīng)最適溫度和最適pH,研究金屬離子對(duì)酶的影響,計(jì)算出絞股藍(lán)皂苷糖苷酶的動(dòng)力學(xué)方程參數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 絞股藍(lán)皂苷糖苷粗酶的活力檢測(cè)

以20%的槐花為誘導(dǎo)物配制培養(yǎng)基裝入三角瓶中,121 ℃濕熱滅菌20 min,無菌條件下接入菌種Absidiasp.GYP4r數(shù)環(huán),30 ℃ 下培養(yǎng)6～7 d,提取粗酶液備用。配制1 mg/mL 的絞股藍(lán)皂苷0.1 mL作為底物與等體積的粗酶液在40 ℃ 下反應(yīng)24 h后,向反應(yīng)液中加入0.2 mL的水飽和正丁醇溶液終止反應(yīng),經(jīng)過短暫離心后,取上層(正丁醇層)TLC點(diǎn)板,并與底物作對(duì)比。由檢測(cè)的結(jié)果圖1可知,該粗酶液具有酶活力。

底,絞股藍(lán)皂苷底物;1、2,底物與粗酶液反應(yīng)產(chǎn)物

圖1 絞股藍(lán)皂苷的酶解薄層層析圖

Fig.1 Result of enzyme reaction of gypenosidase

2.2 絞股藍(lán)皂苷酶的純化與分子質(zhì)量的檢測(cè)

純化柱經(jīng)過堿酸反復(fù)處理,醋酸-醋酸鈉緩沖液平衡后,向柱中加入0.8 mL 粗酶液,先用少量的醋酸-醋酸鈉緩沖液將未吸附的蛋白質(zhì)洗脫下來,然后用不同濃度的KCl梯度洗脫，同時(shí)以3 min/ 管的速度收集洗脫液,并檢測(cè)OD值,得到相應(yīng)的洗脫曲線如圖2所示。

圖2 絞股藍(lán)皂苷酶梯度洗脫曲線圖

取各個(gè)吸收峰的峰值管收集的洗脫液0.1 mL,與等體積的絞股藍(lán)皂苷底物在pH 5.0,40 ℃下反應(yīng)24 h,然后加0.2 mL水飽和正丁醇終止反應(yīng),取正丁醇層,TLC點(diǎn)板結(jié)果如圖3所示,16、19管收集的酶液具有相對(duì)較強(qiáng)的酶活力。

底,絞股藍(lán)皂苷底物;16、19,純化后收集酶液的管號(hào)

圖3 提純后的酶薄層層析圖譜

Fig.3 The layer chromatogram of purified enzyme activity

分別取14～22號(hào)管收集的酶液0.8 mL加0.36 mL三氯乙酸,4 ℃靜置沉淀10 min,4 ℃下離心5 min,倒掉上清,用濾紙吸掉殘余的水分,向其中加入50 μL的丙酮,4 ℃下離心5 min,棄丙酮并用濾紙吸干,加50 μL醋酸-醋酸鈉緩沖液和等體積的上樣緩沖液將蛋白質(zhì)溶解,煮沸3～5 min。將處理好的樣品進(jìn)行凝膠電泳，檢測(cè)結(jié)果如圖4所示,16、19號(hào)的酶液得到電泳圖譜比較清晰,易于分析。

電泳條帶為單帶,說明該蛋白質(zhì)是純的蛋白質(zhì)。再根據(jù)蛋白質(zhì)的遷移率與蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)關(guān)系繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線,經(jīng)計(jì)算處理得到回歸方程logY=5.0-0.91X,再將待測(cè)的蛋白質(zhì)遷移率代入方程中,計(jì)算出純化后蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量約為68 ku。

16、19為提純后的酶

圖4 絞股藍(lán)皂苷提純酶SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖

Fig.4 Polyacrylamide gel SDS electrophoreses of purified gypenosidase

2.3 酶的最適pH 及穩(wěn)定性的研究

分別配制0.02 mol/L pH為2.2、3～10的緩沖液，將絞股藍(lán)皂苷溶解作為底物,40 ℃下保持30 min,取0.1 mL的酶液與等體積的底物混合,40 ℃下反應(yīng)24 h,然后加0.2 mL的水飽和正丁醇終止反應(yīng),振蕩分層后取上層作薄層層析,檢測(cè)相對(duì)酶活力,繪制pH的穩(wěn)定性曲線如圖5所示。由圖5可以看出,酶反應(yīng)的最適pH為5,在pH 2.2～8.0相對(duì)酶活力大于50%,此范圍即為酶的pH穩(wěn)定范圍。

圖5 絞股藍(lán)皂苷糖苷酶的最適pH及穩(wěn)定性曲線

2.4 酶的最適溫度及穩(wěn)定性的研究

在pH 5.0的條件下,取0.1 mL絞股藍(lán)皂苷底物與等體積的酶液混合,分別在20～80 ℃下反應(yīng)24 h,然后加0.2 mL的水飽和正丁醇終止反應(yīng),振蕩分層后取上層作薄層層析,檢測(cè)相對(duì)酶活力,繪制溫度穩(wěn)定曲線如圖6所示。由圖6可知,在溫度為40 ℃時(shí)相對(duì)酶活力和酶活均為最高,因此確定酶反應(yīng)的最適溫度為40 ℃,相對(duì)酶活力大于50%的區(qū)間為20～60 ℃,此區(qū)間即為酶的溫度穩(wěn)定性區(qū)間。

圖6 絞股藍(lán)皂苷糖苷酶的最適溫度曲線

Fig.6 Optimal temperature and temperature stability of gypenosidase

2.5 金屬離子對(duì)絞股藍(lán)皂苷糖苷酶的影響

以絞股藍(lán)皂苷作為酶反應(yīng)底物,向反應(yīng)體系中加入不同濃度的7種金屬離子,在pH 5.0、40 ℃ 下反應(yīng)24 h,薄層層析檢測(cè),計(jì)算相對(duì)酶活力,結(jié)果如表1所示。由表1可以看出,Na+、K+、Mg2+、Zn2+、Ca2+、Fe3+對(duì)絞股藍(lán)皂苷糖苷酶的影響不大,而Cu2+對(duì)該酶有一定的抑制作用，并且抑制作用隨著Cu2+的濃度的增大而增強(qiáng),當(dāng)Cu2+濃度達(dá)到200 mmol/L的時(shí)候,絞股藍(lán)皂苷糖苷酶的相對(duì)酶活力降至45.5%。

表1 金屬離子對(duì)絞股藍(lán)皂苷糖苷酶相對(duì)酶活力的影響

Tab.1 Effect of metal ions on enzyme relative activity %

2.6 絞股藍(lán)皂苷糖苷酶米氏常數(shù)的測(cè)定

將1、2、4、6、8 mg/mL不同質(zhì)量濃度的底物與酶液反應(yīng),薄層層析檢測(cè)酶活力,繪制米氏常數(shù)雙倒數(shù)曲線,如圖7所示。根據(jù)圖7得到雙倒數(shù)曲線方程為1/V=30.83/S+2.17,其中Vmax=0.46 mmol/(L·h),Km=14.20 mmol/L。

圖7 絞股藍(lán)皂苷糖苷酶的Lineweaver-Burk圖

3 結(jié) 論

由Absidiasp. GYP4r菌所產(chǎn)的絞股藍(lán)皂苷糖苷酶，經(jīng)柱純化后,SDS-PAGE檢驗(yàn)得到單帶,證明其為純酶,分子質(zhì)量約為68 ku。

酶的性質(zhì)研究結(jié)果表明,該酶的最適pH為5.0,酶反應(yīng)最適溫度為40 ℃；該酶在20～60 ℃,pH 2.2～8.0酶活力相對(duì)穩(wěn)定。Na+、K+、Mg2+、Zn2+、Fe3+、Ca2+對(duì)該酶沒有影響,Cu2+對(duì)酶活力有一定的抑制作用。該酶的米常數(shù)值為14.20 mmol/L,最大反應(yīng)速率為0.46 mmol/(L·h)。

以上研究結(jié)果為今后絞股藍(lán)皂苷糖苷酶的開發(fā)利用及制備高活性低糖基絞股藍(lán)皂苷提供了參考依據(jù)。

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