成 功, 裴 贏 瑩, 張 公 亮, 侯 紅 漫

( 大連工業(yè)大學 食品學院, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

仿刺參(Apostichopusjaponicus)作為餐桌上的佳肴早已聞名遐邇。2003年,我國海參的總產(chǎn)量只有3.9萬t左右,2008年已經(jīng)達到了9萬t,經(jīng)濟總產(chǎn)值超過200億元。但是,隨著海參養(yǎng)殖量的增加,海區(qū)的養(yǎng)殖壓力加大,海水污染嚴重,加上海參本身的水分、蛋白質含量高,是一種很好的培養(yǎng)基,使得海參體內外含有豐富的微生物類群,甚至存在著多種致病菌[1]。因此,近年來頻繁出現(xiàn)“腐皮綜合癥”,導致海參大批量死亡[2]。

目前,國內外對海參微生物菌群的研究還不夠系統(tǒng),特別是海參體表微生物的組成更是少有報道。孫奕等[3]從刺參前后消化管、體腔液和表皮上分離到359株細菌分別屬于弧菌屬、假單胞菌屬、奈瑟氏球菌屬(Neisseria)、不動桿菌屬、柄桿菌屬(Caulobacter)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、微球菌屬(Micrococcus)、黃單胞菌屬(Xanthomonas)、產(chǎn)堿菌屬(Alcaligenes)這11個主要菌屬。向怡卉等[4]對大連產(chǎn)海參(仿刺參)不同部位的細菌進行了分離鑒定,得到3種菌株,分別為Kocuriaroseastackebrandt、棒狀桿菌(Corynebacteriumsp.)和有毒威克斯菌(WeeksellaviroseHolmes),其中有毒威克斯菌是一種致病菌,其余兩種為優(yōu)勢菌。

本實驗對大連冬、春兩季海參體表微生物進行分離培養(yǎng),同時結合表型鑒定和分子遺傳學鑒定的方法對未知菌進行準確定位,較為系統(tǒng)地分析了海參體表的微生物菌群,為海參病害原因分析、防治以及海參生產(chǎn)加工提供一定的參考依據(jù)。

1 實 驗

1.1 材 料

2009年11月23日和2010年3月5日從大連長興鮮活海產(chǎn)品市場購買質量約為200 g的大連仿刺參,在運輸過程中加養(yǎng)殖所用海水,并且充氧以保持樣品的鮮活狀態(tài),30 min內運至實驗室。用滅菌生理鹽水沖洗數(shù)遍,無菌條件下剪取各部分體表樣品。

1.2 樣品處理

稱取10 g體表樣品加入90 mL無菌生理鹽水,用滅菌勻漿器充分研磨均勻后,以10倍遞增稀釋法進行稀釋,取3個合適的稀釋度涂布于2216培養(yǎng)基[5]、葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基和TCBS培養(yǎng)基[6]。每個稀釋度做3個平行,25 ℃培養(yǎng)48 h。

1.3 細菌的分離純化

挑選菌落數(shù)在30～300個的平板,綜合菌落形態(tài)和細胞形態(tài)分離純化所有菌株。

1.4 細菌的鑒定

1.4.1 細菌的形態(tài)和理化特性檢測

參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》。對分離純化的菌株作革蘭氏染色,在光學顯微鏡下觀察細菌形態(tài),然后進行生理生化特性測定,并作初步鑒定和常規(guī)分類。

1.4.2 模板制備及16S rDNA的PCR擴增

將初步鑒定分類好的細菌接種于相應的液體培養(yǎng)基,25 ℃,150 r/min過夜培養(yǎng)后,按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明提取細菌DNA,作為PCR反應的DNA模板。PCR擴增引物為通用引物27f和1492r,PCR擴增條件:94 ℃ 5 min,30個循環(huán)(94 ℃ 60 s；60 ℃ 40 s；72 ℃ 90 s),72 ℃續(xù)延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4.3 16S rDNA序列分析

PCR擴增產(chǎn)物送至測序公司測序。將測序結果在NCBI網(wǎng)站中利用Blast軟件在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行相似性比較,選取同源性較高的相關菌株的16S rDNA序列作為參比對象,用Clustal X軟件按照最大同源性的原則進行多序列比對。

1.4.4 構建系統(tǒng)進化樹

采用MEGA4.0軟件依據(jù)鄰位相連法對所有分離鑒定菌株的16S rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中序列進行分析比較,繪出系統(tǒng)進化樹。

2 結果與討論

2.1 細菌的分離與培養(yǎng)

挑取稀釋度為10-3的樣品分別涂布于3種培養(yǎng)基,不同培養(yǎng)基獲得的菌落數(shù)量有明顯的差異,對3種培養(yǎng)基進行菌落計數(shù),結果如表1所示。

表1 仿刺參體表菌群的數(shù)量

Tab.1 The quantity of the surface microflora ofApostichopusjaponicus

組別c/(μmol·L-1)t/h244872A值抑制率/%A值抑制率/%A值抑制率/%對照組01.414±0.0041.376±0.0221.192±0.008實驗組1001.128±0.003a20.251.015±0.001a26.220.791±0.003a33.651500.874±0.003a38.190.815±0.003a40.750.604±0.003a49.262000.642±0.000 6a54.620.534±0.002a61.170.420±0.003a64.782500.513±0.006a63.720.405±0.008a70.600.283±0.002a76.253000.317±0.003a77.600.273±0.003a80.160.072±0.007a93.98注:a表示差異P<0.05。

2.2 生理生化反應

從仿刺參體表分離得到的菌株經(jīng)革蘭氏染色后,鏡檢觀察菌體形態(tài)和菌落形態(tài),根據(jù)鏡檢結果將其劃分為10組,然后對這10組菌做常規(guī)生理生化實驗,結果如表2所示。

表2 細菌生理生化結果

Tab.2 The results of bacterial physiological and biochemical analysis

組別12345678910形狀rrrrrc/rrrrc革蘭氏染色-------+++運動性+++++--++-接觸酶-++++-++++氧化酶++++-+----葡萄糖產(chǎn)酸+--+++++++葡萄糖產(chǎn)氣----------吲哚------+--+明膠液化+-++++-++-檸檬酸鹽-+----++--注:r為桿菌,c/r為球桿菌,c為球菌;“+”代表陽性反應;“-”代表陰性反應。

2.3 菌株16S rDNA的PCR擴增

將菌株的PCR擴增產(chǎn)物通過0.8%的瓊脂糖凝膠電泳,得到PCR擴增產(chǎn)物的大小1 500 bp左右,凝膠電泳圖如圖1所示。圖1中的目的條帶大小為1 500 bp,為各菌株的16S rDNA,之后將各菌株的PCR擴增產(chǎn)物送至測序公司測序。

圖1 菌株PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖

2.4 菌株16S rDNA的同源性比對

將測定菌株的16S rDNA的序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中,與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知16S rDNA序列相似性最高為100%,最低為97%。結果表明,從大連地區(qū)仿刺參體表分離得到的細菌分屬于10個菌,分別為交替假單胞菌屬、希瓦氏菌屬、假單胞菌屬、弧菌屬、枯草芽孢桿菌、變形菌屬、Alteromonadaceas、不動桿菌屬、解淀粉芽孢桿菌、腐生葡萄球菌。仿刺參體表細菌的菌相組成如表3所示。

2.5 仿刺參體表可培養(yǎng)細菌的系統(tǒng)發(fā)育學分析

仿刺參體表細菌的系統(tǒng)進化樹分析表明,所得到的19條有效序列中交替假單胞菌屬(Pseudoalteromonas)和弧菌屬(vibrio)同屬于γ-變形菌綱；變形桿菌屬(Proteobacterium)、腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloiquefaciens)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)同源關系較近；Bacillussubtilis(AY881647.1)與Vibrio-cyclitrophicus(AM422804.1)同源關系較近。仿刺參體表細菌的系統(tǒng)進化樹如圖2所示。

圖2 仿刺參體表細菌系統(tǒng)進化樹

Tab.3 The composition of bacterial flora on the surface ofApostichopusjaponicus

組別細菌冬季海參春季海參綜合菌株數(shù)/個所占比例/%菌株數(shù)/個所占比例/%菌株數(shù)/個所占比例/%革蘭氏陰性菌5484.33278.18681.91交替假單胞菌屬1828.1819.52623.82弧菌屬1320.31024.62422.93希瓦氏菌屬1117.2717.11817.14假單胞菌屬46.212.454.85變形菌屬34.712.443.86Alteromonadaceas——24.821.97不動桿菌屬57.837.387.6革蘭氏陽性菌1015.7921.91918.18枯草芽孢桿菌69.337.398.69解淀粉芽孢桿菌46.424.865.710腐生葡萄球菌——49.843.8總計6410041100105100注:“—”代表未檢測出。

3 討 論

本研究表明,從大連仿刺參體表分離得到的細菌中的假單胞菌屬、弧菌屬、不動桿菌屬、芽孢桿菌屬為海水中主要的細菌[7-8],說明這些細菌很可能是附生在仿刺參體表的。從仿刺參中分離得到大量的交替假單胞菌,交替假單胞菌是海洋底部泥土中一種非常常見和重要的細菌,是一種條件致病菌,在海帶、海藻、魚類、貝類等海洋生物體內都有分布,它的營養(yǎng)要求低,能生活在各種環(huán)境中。交替假單胞菌能產(chǎn)生內毒素、脂酶、卵磷脂酶、蛋白酶及外毒素等,這些物質很多與致病性有關。仿刺參體表中分離出大量該菌種,很可能與仿刺參的生活習性有關。目前關于交替假單胞菌的致病性研究和關于其性質的報道比較少,孟慶國等[9]在國內外首次報道交替假單胞菌是養(yǎng)殖刺參潰瘍性的病原菌。

腐敗和致病菌是危害水產(chǎn)品細菌學研究的兩個主要方面,其中對腐敗菌的研究更為普遍。假單胞菌和希瓦氏菌為常見優(yōu)勢腐敗菌,特別是在水產(chǎn)品的冷卻鏈過程中假單胞菌和希瓦氏菌為鮮活水產(chǎn)品的特定腐敗菌[10]。本實驗在冬春兩季的海參體表均分離出一定數(shù)量的希瓦氏菌和假單胞菌,因而建議盡可能縮短海參加工前的冷藏過程。

許多報告指出,在自然環(huán)境中有相當多的菌種(約90%～99%)用傳統(tǒng)的純培養(yǎng)方法無法培養(yǎng)出來[11]；并且利用傳統(tǒng)技術對微生物菌群進行培養(yǎng)時,會不可避免地造成菌株的富集或衰減,對結果造成偏差。如果將傳統(tǒng)的純培養(yǎng)技術和非培養(yǎng)技術結合使用,則可以相輔相成,更全面地反映復雜環(huán)境中微生物群落的種類。

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