彭 微，汪世平，鄭長(zhǎng)黎，宋海鵬，劉 懷

業(yè)已證明，疫苗是人們控制傳染性疾病傳播的最為經(jīng)濟(jì)有效的措施之一。近幾年來(lái)，中南大學(xué)湘雅血吸蟲病研究室先后構(gòu)建了幾種抗日本血吸蟲病天然分子疫苗編碼基因相關(guān)的核酸疫苗，其中包括編碼SIEA26－28 k Da分子抗原的p VAX1／Sj RPS4，以及編碼Sj31／32k Da分子抗原的p VAX1／Sj CB等。在此基礎(chǔ)上，本研究將已經(jīng)構(gòu)建成功的p VAX1／Sj RPS4·CB多價(jià)疫苗免疫小鼠，進(jìn)一步觀察疫苗免疫后對(duì)小鼠肝臟蟲卵肉芽腫的病理形態(tài)學(xué)改變及周長(zhǎng)和面積的影響，從而為該疫苗的免疫保護(hù)力研究提供有意義的形態(tài)學(xué)資料。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 陽(yáng)性釘螺系中南大學(xué)湘雅血吸蟲病研究室提供，從人工毛蚴感染釘螺后篩選獲得；清潔級(jí)昆明小鼠，雌性，體重25～30 g，由湘雅中南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供。

1．2 質(zhì)粒 p VAX1／Sj RPS4、p VAX1／Sj CB、p VAX1／Sj RPS4·CB由湘雅血吸蟲病研究室構(gòu)建并保存。

1．3 動(dòng)物分組及實(shí)驗(yàn)方案 55只昆明小鼠隨機(jī)分成5組：PBS對(duì)照組、p VAX1空質(zhì)粒組、p VAX1／Sj RPS4單價(jià)疫苗組、p VAX1／Sj CB單價(jià)疫苗組、p VAX1／Sj RPS4·CB多價(jià)疫苗組。每組注射相應(yīng)質(zhì)粒100μg或等量PBS，注射部位為左后腿股四頭肌。每隔2周加強(qiáng)免疫1次，共3次。末次免疫后2周經(jīng)腹部皮膚攻擊感染20±1條日本血吸蟲尾蚴，感染后第6周處死小鼠。

1．4 肝組織石蠟切片及HE染色 隨機(jī)自各組取5只小鼠剖殺，肝組織經(jīng)固定、脫水、透明、浸蠟、包埋，制成石蠟組織塊，制成10μm的連續(xù)切片，按常規(guī)方法進(jìn)行HE染色。

1．5 蟲卵肉芽腫周長(zhǎng)和面積的測(cè)量 采用UVP成像系統(tǒng)，在100×視野下，每組選取15個(gè)肉芽腫，測(cè)量肉芽腫的面積和周長(zhǎng)，測(cè)量數(shù)據(jù)采用方差分析檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，并用SPSS10．0統(tǒng)計(jì)軟件處理。

2 結(jié) 果

2．1 小鼠肝臟組織病理學(xué)變化 肝組織切片鏡下顯示，PBS對(duì)照組肝組織中肝細(xì)胞變性、壞死，可見大量的蟲卵肉芽腫形成，肉芽腫體積較大，肉芽腫內(nèi)有多個(gè)蟲卵聚集，周圍有大量淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和漿細(xì)胞浸潤(rùn)，蟲卵周圍可見到少量梭形的成纖維細(xì)胞及類上皮細(xì)胞（圖1）。p VAX1空質(zhì)粒組也可見大量肉芽腫，周圍有大量淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，但是肝細(xì)胞變性壞死程度較PBS對(duì)照組輕（圖1）。p VAX1／Sj RPS4、p VAX1／Sj CB組疫苗免疫，尾蚴攻擊后肝臟病變大致相同，其病變明顯減輕，小鼠肝細(xì)胞混濁腫脹，匯管區(qū)蟲卵肉芽腫數(shù)量減少，體積減小，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)主要以嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞為主，可見少量巨噬細(xì)胞和漿細(xì)胞（圖1）。p VAX1／Sj RPS4·CB病變程度最輕，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，蟲卵肉芽腫周圍炎癥反應(yīng)輕，細(xì)胞浸潤(rùn)不明顯，肉芽腫面積較小（圖1）。

2．2 對(duì)蟲卵肉芽腫形成影響的觀察 對(duì)肝臟蟲卵肉芽腫測(cè)量發(fā)現(xiàn)，疫苗免疫、尾蚴攻擊后，疫苗組的肉芽腫平均周長(zhǎng)分別與p VAX1空質(zhì)粒組、PBS對(duì)照組相比，均數(shù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝6705．41，P＜0．05）；其肉芽腫平均面積分別與p VAX1空質(zhì)粒組、PBS對(duì)照組相比，均數(shù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝2 901．28，P＜0．05）。兩組單價(jià)疫苗組和多價(jià)疫苗組相比，蟲卵肉芽腫的平均面積和周長(zhǎng)也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），見表1。

表1 疫苗免疫、尾蚴攻擊后小鼠肝臟蟲卵肉芽腫測(cè)量結(jié)果Tab．1 Results of egg granulomas measurement after the vaccine i mmunized mice challenged by Sj cercariae

3 討 論

圖1 肝臟蟲卵肉芽腫HE染色（×100）A ：p VAX1組 （HE染色×100）；B：PBS組（HE染色×100）；C：p VAX1／Sj RPS4組（HE染色×100）；D：p VAX1／Sj CB組（HE染色×100）；E：p VAX1／Sj RPS4·CB組（HE染色×100）Fig．1 Liver egg granulomas（HE staining，×100）A：p VAX1 group；B：PBS group；C：p VAX1／Sj RPS4 group；D：p VAX1／Sj CB gr oup；E：p VAX1／Sj RPS4·CB gr oup

血吸蟲病的主要病變是蟲卵引起肝臟和腸壁組織發(fā)生蟲卵肉芽腫和組織纖維化。因此，肝組織的病理學(xué)改變可以直接反映疫苗的抗病效果。包括蟲卵結(jié)節(jié)的數(shù)目、大小、肝臟組織病理變化等。段義農(nóng)等［1］研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)SEA處理的小鼠感染血吸蟲后，肝臟中蟲卵肉芽腫的直徑小于對(duì)照組。李文桂等［2］研究顯示用BCG－Sj 26GST疫苗接種小鼠后肝臟肉芽腫數(shù)目少，體積小，平均周長(zhǎng)和平均面積小于對(duì)照組。應(yīng)用重組Sj26 GST（reSjc GST）抗原免疫小鼠，可誘導(dǎo)產(chǎn)生18．2%～30．5%的減蟲率和21．7%～59%的減卵率，同時(shí)肝臟蟲卵肉芽腫明顯變小［3］。Mah moud H Ro meih 等［4］對(duì)埃及曼氏血吸蟲疫苗研究中發(fā)現(xiàn)免疫組較對(duì)照組肉芽腫結(jié)節(jié)數(shù)減少，體積減小。嗜酸性粒細(xì)胞減少明顯。萬(wàn)中原等［5］從日本血吸蟲成蟲分離純化出天然28、31／32和97 k D蛋白，混合成多價(jià)疫苗免疫小鼠，獲得較高的減蟲率和肝減卵率，而且研究發(fā)現(xiàn)疫苗具有一定的抑制蟲卵肉芽腫的作用。秦永華等［6］發(fā)現(xiàn)日本血吸蟲p VAX1／Sj RPS4·CB多價(jià)疫苗免疫昆明小鼠，尾蚴攻擊感染后減蟲率為25．2%～31．3%，每雌減卵率為24．1%～31．5%，每克肝減卵率為44．9%～58．8%，提示該疫苗可產(chǎn)生較好的保護(hù)性免疫反應(yīng)。本研究在此基礎(chǔ)上對(duì)p VAX1／Sj RPS4·CB多價(jià)疫苗組免疫小鼠后的組織切片進(jìn)行觀察，結(jié)果顯示，肝臟病變程度較輕，蟲卵數(shù)量較少，肝小葉結(jié)構(gòu)較完整，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)少。隨后，測(cè)量其肝臟蟲卵肉芽腫的周長(zhǎng)和面積，同樣發(fā)現(xiàn)肉芽腫的平均面積和周長(zhǎng)有明顯減小，具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），表明p VAX1／Sj RPS4·CB多價(jià)疫苗組具有明顯的抑制蟲卵肉芽腫的效果，蟲卵結(jié)節(jié)明顯減小。

多價(jià)DNA疫苗是將不同抗原分子序列的堿基通過(guò)一定的方式連接在一起，共同插入到同一真核載體內(nèi)，并在宿主體內(nèi)共表達(dá)。石佑恩等［7］用RTPCR從成蟲體內(nèi)擴(kuò)增Sj GST，構(gòu)建大腸桿菌－分支桿菌穿梭表達(dá)質(zhì)粒PBCG－Sj 26 I－IV，再將其依次轉(zhuǎn)化到大腸桿菌、恥垢分枝桿菌中，篩選出重組恥垢分枝桿菌疫苗和重組BCG多價(jià)疫苗，用以免疫小鼠，獲得27．36%減蟲率和60．50%的肝卵減少率。

張冉等［8］發(fā)現(xiàn)多價(jià)疫苗 VR1012－Sj GST－Sj 31和VR1012－Sj GST－Sj 32均能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生一定水平的抗血吸蟲感染保護(hù)作用，其免疫效果大于單價(jià)疫苗。

以 多 價(jià) DNA 疫 苗 p BK－Sj 26－Sj 23 和 p BKSj 23－Sj 23免疫小鼠能產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答。減蟲率為28．12%和28．50%，與單價(jià)疫苗比較有所提高。［9］

王曉婷［10］的研究中同樣也發(fā)現(xiàn) pc DNA3．1－TPI－linker－（CDR3）6多價(jià)DNA 疫苗減蟲率和減卵率均顯著高于單價(jià)DNA疫苗組。證明多價(jià)DNA聯(lián)合疫苗中的各單價(jià)分子發(fā)揮協(xié)同作用，比單價(jià)DNA疫苗抗感染力有了明顯提高，對(duì)宿主的保護(hù)力顯著增強(qiáng)［11］。從而解決了單價(jià)DNA疫苗免疫力保護(hù)力低的問(wèn)題。本研究p VAX1／Sj RPS4·CB多價(jià)疫苗組和p VAX1／Sj RPS4、p VAX1／CB單價(jià)疫苗組相比，肝臟組織切片病變程度更輕，肝臟蟲卵肉芽腫周長(zhǎng)和面積有明顯減小，提示多價(jià)疫苗比單價(jià)疫苗抑制蟲卵肉芽腫的作用更好，可以產(chǎn)生比單價(jià)疫苗更優(yōu)的免疫保護(hù)效果。

總之，基因重組DNA聯(lián)合疫苗具有增強(qiáng)免疫保護(hù)力，減少免疫次數(shù)，操作簡(jiǎn)單，節(jié)約成本等特點(diǎn)。而且，不存在雞尾酒式混合疫苗中可能增加的毒素問(wèn)題，具有廣泛的研究前景和開發(fā)價(jià)值。p VAX1載體是通過(guò)pc DNA3．1改良而新開發(fā)的被美國(guó)藥品及食品鑒定委員會(huì)驗(yàn)證批準(zhǔn)的用于疫苗臨床使用的真核表達(dá)載體。本實(shí)驗(yàn)采用它作為多價(jià)疫苗的載體，為日本血吸蟲疫苗今后在臨床的應(yīng)用提供了一定的依據(jù)和基礎(chǔ)。

［1］Duan YN，Li R，Zhou Q，etal．Effects of i mmuno－tolerance of the for mation Schistoso ma j aponicu m egg granulo ma in mice［J］．Chin J Parasit Dis Contr，2001，14（4）：294－296．（in Chinese）段義農(nóng)，李榮，周全，等．免疫耐受對(duì)日本血吸蟲蟲卵肉芽腫形成的影響［J］．中國(guó)寄生蟲病防治雜志，2001，14（4）：294－296．

［2］Li WG，Shi YE，Chen Y，etal．Pat hological changes of the liver of BALB／c mice i mmunized wit h reco mbinant BCG－SJ26 GST vaccine of Schistoso me［J］．Chin J Parasit Dis Contr，2000，13（2）：139－141．（in Chinese）李文桂，石佑恩，陳焰，等．血吸蟲重組BCG－Sj26 GST疫苗接種BALB／c鼠后肝臟病理學(xué)變化［J］．中國(guó)寄生蟲病防治雜志，2000，13（2）：139－141

［3］Li LZ，Shi YE，Jiang K，etal．Immune effect induced by S．j aponicu m DNA vaccine wit h different vectors in mice［J］．Huazhong Univ Sci Tech Healt h Sci，2003，32 （1）：325－618．DOI：cnki：ISSN：0258－2090．0．2003－01－001

［4］Ro meih MH，Hassan H M，Shousha TS，etal．Immunization against Egyptian Schistoso ma mansoni infection by multivalent DNA vaccine［J］．Acta Biochi m Biophys Sin，2008，40（4）：327－338．DOI：10．1093／abbs／g mp062

［5］Wan ZY，Li YL，Han JJ，etal．St udy on the pr otection of multivalent molecular vaccine of Schistosoma j aponicu m against ex－peri mental infection wit h Schistosoma j aponicu m in mice［J］．Chin J Parasit Dis Contr，1998，21（1）：16－18．（in Chinese）萬(wàn)中原，李雍龍，韓家俊，等．日本血吸蟲多價(jià)分子疫苗的保護(hù)性免疫力研究［J］．中國(guó)寄生蟲病防治雜志，1998，21（1）：16－18．

［6］Qin YF．Studies on the bivalent vaccine p VAX1／Sj RPS4·CB－the target gene relevant to the nat ural molecule and cocktail vaccines against Schistoso ma j aponicu m［D］．Changsha：Central Sout h U－niversity，2008：30－31．（in Chinese）秦永華．抗日本血吸蟲病天然分子靶基因p VX1／Sj RPS4·CB雙價(jià)疫苗與聯(lián)合 免疫的研究［D］．長(zhǎng)沙：中南大學(xué)碩士論文，2008：30－31．

［7］Shi YE ，Han JJ，Li WG ，etal．Study on BCG genetic engineering multivalent vaccine of Schistoso ma j aponicu m ［J］．Chin J Parasit Dis Contr，1998，10：27－33．（in Chinese）石佑恩，韓家俊，李文桂，等．日本血吸蟲基因工程BCG多價(jià)疫苗的研究［J］．中國(guó)血吸蟲病防治雜志，1998，10：27－33．

［8］Zhang R，Yi XY，Zeng XF，etal．DNA vaccine of VR1012－SJGST－SJ31 and VR1012－SJGST－SJ32 against Schistosoma j aponicu m：expression and protective i mmunity in mice［J］．Chin J Schisto Contr，2004，16（1）：27－31．（in Chinese）張冉，易新元，曾憲芳，等．日本血吸蟲二價(jià)DNA疫苗的免疫保護(hù)效果的研究［J］．中國(guó)血吸蟲病防治雜志，2004，16（1）：27－31．

［9］Li LZ，Shi YE，Jiang K，etal．St udy on the i mmune effect of multiantigenic DNA vaccine p BK－Sj 26（Sj32）－Sj 23 of Schistosoma j aponicu m［J］．Acta Univ Med Tongji，2001，30（5）：404－406．（in Chinese）李柳哲，石佑恩，江侃，等．日本血吸蟲多價(jià)DNA疫苗p BK－Sj26（Sj32）－Sj23免疫效果觀察［J］．同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，30（5）：404－406．

［10］Wang XT，Zhu YC，Guan XH，etal．Constr uction of multivalent DNA vaccine of Schistosoma j aponicu m and its identification［J］．Chin J Schisto Contr，2005，14（3）：84－87．（in Chinese）王曉婷，朱蔭昌，管曉虹，等．日本血吸蟲多價(jià)DNA疫苗的構(gòu)建及鑒定［J］．中國(guó)血吸蟲病防治雜志，2005，14（3）：84－87．

［11］Feng QM，Zhang SJ，Wang SP．Reaserch pr ogress on co mbined i mmunization of DNA vaccine against Schistoso ma j aponicu m［J］．Chin J Zoonoses，2012，28（7）：728－734．（in Chinese）馮其梅，張樹菊，汪世平．日本血吸蟲DNA疫苗聯(lián)合免疫的研究進(jìn)展［J］．中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2012，28（7）：728－734．