張香齋，陳麗鳳，陳 娟，王秋悅，劉朋朋，石 芳，鄒亞學(xué)

(河北科技師范學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北秦皇島，066600)

梨形蟲病是一類經(jīng)硬蜱傳播，由梨形蟲綱巴貝斯科或泰勒科原蟲引起的血液原蟲病的總稱。迄今為止，全世界已記載的各種哺乳動(dòng)物的巴貝斯蟲有67種，泰勒蟲有13種［1］。牛梨形蟲病是世界性分布的嚴(yán)重危害養(yǎng)牛業(yè)發(fā)展的一類重要疾病，給畜牧業(yè)和國民經(jīng)濟(jì)造成巨大損失。在我國已報(bào)道的病原有牛巴貝蟲(Babesia bovis)、雙芽巴貝蟲(B．bigemina)、大巴貝蟲(B．major)、卵形巴貝蟲(B．ovata)、一種尚未命名的巴貝蟲(B．sp．)［2］、環(huán)形泰勒蟲(Theileria annulata)、瑟氏泰勒蟲(T．sergenti)和中華泰勒蟲(T．sinensis)［3］。牛梨形蟲病的傳播媒介蜱有3種:殘緣璃眼蜱(Hyalomma detritum)、長角血蜱(Haemaphysalis longicornis)和微小牛蜱(Boophihismicrophis)。據(jù)FAO統(tǒng)計(jì)，世界上有80%的牛遭到蜱的侵襲，僅硬蜱給畜牧業(yè)造成的損失，全球每年就高達(dá)70億美元［4］。本試驗(yàn)應(yīng)用PCR診斷技術(shù)，對采自河北省灤縣某牛場的牛進(jìn)行梨形蟲檢測，以便了解和分析該地區(qū)梨形蟲自然感染狀況，為更好地防治該病提供一些參考。

1 材料與方法

1．1 試驗(yàn)材料

1．1．1 牛血液 采自河北省灤縣某牛場。

1．1．2 主要試劑及緩沖液配制 50 ×TAE:取 Tris堿242 g，冰乙酸57．1 mL，0．5 mol/L EDTA(pH 8．0)100 mL加入純水定容至1 L，儲存?zhèn)溆?蛋白酶K(德國Merck公司)、無水乙醇(天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠)、瓊脂糖(西班牙進(jìn)口分裝)。PCR相關(guān)試劑，2×Taq MasterMix(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)，引物(北京賽百盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)。DL2000(北京博潤德生物科技發(fā)展中心)。

1．1．3 儀器設(shè)備 超級恒溫水浴箱(601型、金壇市醫(yī)療儀器廠)、高速臺式離心機(jī)(TGL-16G，上海安亭科學(xué)儀器廠)、可調(diào)微量移液器(0．1 ～2．5，5 ～50，100 ～1 000 μL，德國普蘭德)、梯度 PCR 儀(Mastercycler gradient，德國Eppendorf公司)、雙穩(wěn)定時(shí)電泳儀(DYY-6C型，北京六一儀器廠)、血液基因組小量提取試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)，基本常規(guī)儀器等均由河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1．2 試驗(yàn)方法

1．2．1 樣本 從唐山灤縣某牛場中抽檢28頭牛，靜脈抽血，加肝素抗凝，分裝入試管，放入冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室，保存待檢。

1．2．2 模板DNA制備 使用血液基因組小量提取試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)按操作說明書操作。

1．2．3 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank上發(fā)表的環(huán)形泰勒蟲Tams1基因序列合成THX-F1/THX-R1和THXF2/THX-R2兩對引物;根據(jù)GenBank上已發(fā)表的牛瑟氏泰勒蟲P32表面蛋白基因序列，合成TSSH-F/TSSH-R引物對;根據(jù)文獻(xiàn)已發(fā)表的巴貝斯蟲18S rRNA基因序列［5，6］，合成BSHY-F/BSHY-R引物對，用于雙芽巴貝斯蟲18S rRNA基因的擴(kuò)增;合成NBBS-F1/NBBS-R1和NBBS-F2/NBBS-R2兩對引物對，用于其它巴貝斯蟲18S rRNA基因的擴(kuò)增，引物名稱及序列見表1。以上梨形蟲中僅環(huán)形泰勒蟲為巢式PCR方法檢測，其余蟲種均為常規(guī)PCR方法檢測。

1．2．4 PCR反應(yīng)體系 PCR擴(kuò)增均在20 μL反應(yīng)體系中進(jìn)行。該體系包括:2×Taq MasterMix 10 μL，上、下游引物各0．5 μL，模板各1．0 μL，超純水補(bǔ)足至20 μL。離心混勻后選擇適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增。

表1 引物名稱及序列

1．2．5 PCR 反應(yīng)參數(shù)

(1)環(huán)形泰勒蟲巢式PCR反應(yīng)參數(shù):第1輪PCR反應(yīng):預(yù)變性94℃，3 min;變性94℃，1 min;退火55℃，1 min;延伸72℃，1 min，40個(gè)循環(huán)，最后延伸72℃，7 min。第2輪PCR反應(yīng)(以第1輪PCR產(chǎn)物為模板):預(yù)變性94℃，3 min;變性94℃，1 min;退火55℃，1 min;延伸72℃，1 min，30個(gè)循環(huán)，最后延伸72℃，7 min。

(2)瑟氏泰勒蟲PCR反應(yīng)參數(shù):預(yù)變性95℃，3 min;變性95℃，2 min;退火63℃，2 min;延伸72℃，2 min，30 個(gè)循環(huán)，最后延伸72 ℃，5 min。

(3)牛雙芽巴貝斯蟲PCR反應(yīng)參數(shù):預(yù)變性94℃，3 min;變性94℃，30 s;退火58．1℃，1 min;延伸72 ℃，1 min，32 個(gè)循環(huán)，最后延伸72 ℃，5 min。

(4)其他牛巴貝斯蟲PCR反應(yīng)參數(shù):預(yù)變性95℃，3 min;變性95℃，2 min;退火63℃，2 min;延伸72℃，2 min;30個(gè)循環(huán)，最后延伸72℃，5min。

1．2．6 電泳檢測 反應(yīng)結(jié)束后取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物于質(zhì)量濃度為10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳30 min，紫外燈下觀察結(jié)果并拍照。

2 結(jié)果與分析

本試驗(yàn)檢測的28個(gè)樣本中，其中7個(gè)樣本擴(kuò)增出了約1 700 bp(圖1，圖2)特異性條帶，雙芽巴貝斯蟲陽性樣本7份，陽性率為25．00%;3個(gè)樣本擴(kuò)增出了約900 bp和1 300 bp兩條特異性條帶(圖3，圖4)，其他牛巴貝斯蟲陽性樣本3份，陽性率10．71%;而環(huán)形泰勒蟲和瑟氏泰勒蟲均未檢測到陽性樣本。

圖1 雙芽巴貝斯蟲18SrRNA基因擴(kuò)增結(jié)果

圖2 雙芽巴貝斯蟲18SrRNA基因擴(kuò)增結(jié)果

圖3 其他牛巴貝斯蟲18SrRNA基因擴(kuò)增結(jié)果

圖4 其他牛巴貝斯蟲18SrRNA基因擴(kuò)增結(jié)果

3 討 論

梨形蟲病是一類必須通過硬蜱傳播的家畜血液原蟲病，侵襲牛的梨形蟲主要是牛雙芽巴貝斯蟲、牛巴貝斯蟲和牛泰勒蟲［7］。我國疆域遼闊，地跨古北、東洋兩大區(qū)，從寒溫帶到熱帶，自然條件復(fù)雜，許多地區(qū)存在著大量可作為本病傳播媒介的硬蜱，因此我國家畜中梨形蟲種類較多，對畜牧業(yè)的威脅很大。羅建勛等獲得34個(gè)牛和羊的梨形蟲不同地區(qū)分離株，并對病原進(jìn)行了分類鑒定，結(jié)果共分離到牛羊梨形蟲9種、21株，牛巴貝斯蟲未定種1株，羊巴貝斯蟲未定種7株，羊泰勒蟲未定種5株［6］。雙芽巴貝斯蟲，分布較廣，主要在南方各省;牛巴貝斯蟲，發(fā)現(xiàn)于貴州、安徽、湖南、陜西及河北等地;卵形巴貝斯蟲，發(fā)現(xiàn)于貴州、湖南、河南及吉林等地;環(huán)形泰勒蟲，分布較廣，主要在內(nèi)蒙古及東北、西北各地;瑟氏泰勒蟲，發(fā)現(xiàn)于貴州、吉林、遼寧、河北、河南、湖南、云南、陜西、甘肅及寧夏。

多年來，為了控制梨形蟲病，世界各國均開展了大量的研究工作，20世紀(jì)80年代以后，隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)在這一領(lǐng)域的不斷應(yīng)用，解決了許多應(yīng)用經(jīng)典生物學(xué)技術(shù)難以證實(shí)或明確的問題，并為梨形蟲病的防治提供了很多新的理論和手段，取得了巨大的成果。國際上，對梨形蟲病的診斷方法己從血涂片檢查、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、間接熒光抗體發(fā)展到了DNA探針、PCR和酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)等更快速、準(zhǔn)確的檢測方法。Martin-Sanchez等［8］建立了巢式PCR技術(shù)，將采集自牛環(huán)形泰勒蟲病不同流行地區(qū)的214份樣品分別用血涂片顯微鏡檢查、熒光抗體和PCR檢測，結(jié)果陽性率分為62．26%，69．86%，78．04%。顯然，PCR方法的檢出率高于其它兩種方法。本試驗(yàn)參考的GenBank上發(fā)表的環(huán)形泰勒蟲Tams1基因序列、牛瑟氏泰勒蟲P32表面蛋白基因序列以及文獻(xiàn)已發(fā)表的巴貝斯蟲18S rRNA基因序列［9，10］合成的梨形蟲特異引物，現(xiàn)已廣泛用于種的鑒定和基因相關(guān)性的研究。本試驗(yàn)采用PCR技術(shù)，對河北省灤縣某牛場采集的28份血樣進(jìn)行梨形蟲檢測，結(jié)果顯示，?？偢腥韭蕿?5%(7/28)，感染牛中均有雙芽巴貝斯蟲感染(7/28)，與其他牛巴貝斯蟲混合感染率為10．71%，表明河北省灤縣牛梨形蟲的自然感染情況較為嚴(yán)重，應(yīng)給予高度重視。

［1］蔣金書．動(dòng)物原蟲病學(xué)［M］．北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2000．

［2］羅建勛，殷宏，劉光遠(yuǎn)，等．牛的巴貝斯蟲18S rRNA基因序列比較研究［J］．畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2005，36(9):906-911．

［3］白啟，劉光遠(yuǎn)，韓根鳳，等．在我國新發(fā)現(xiàn)的一種牛的泰勒蟲(Theilria)未定種［J］．中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，1995，15(1):16-20．

［4］SAUER J R，MCSWAIN J L，BOWMAN A S，et al．Tick salivary gland physiology［J］．Annu Rev Entoml，1995，40:245-267．

［5］王修文，林桌臣，危粹凡．貴州牛的原蟲初步調(diào)查與研究［J］．貴州畜牧獸醫(yī)科技，1984(3):35-40．

［6］羅建勛，殷宏，劉光遠(yuǎn)，等．我國牛羊梨形蟲病病原的收集與鑒定［J］．中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志，2006，24(增刊):48-53．

［7］楊茂生，吳位珩，廖梅，等．牛梨形蟲病的診斷與防治［J］．中國獸醫(yī)寄生蟲病，2008，16(2):48-49．

［8］MARTIN-SANCHEZ J，VISERAS J，ADROHER F J，et al．Nested polymerase chain reaction for detection of Theileria annulata and comparison with conventional diagnostic techniques:its use in epidemiology studies［J］．Parasitology Research，1999，85(3):243-245．

［9］ALL SOPP M T，CAVALIER SMITH T，DE WAAL D T，et al．Phylogeny and evolution of the piroplasms［J］．Parasitol，1994，108:147-152．

［10］REDDY G R，CHAKRABARTI D，YOW ELL C A，et al．Sequence micro hetero geneity of the three small subunit ribosomal RNA genes of Babesia bigemina:expression in erythrocyte culture［J］．Nucleic Acids Res，1991，19(13):3 641-3 645．