劉 旭, 曲桂燕, 周裔彬, 袁 毅, 韓麗君

(1. 安徽農(nóng)業(yè)大學, 安徽 合肥 230036; 2. 中國科學院 海洋研究所, 山東 青島 266071; 3. 中國海洋大學,山東 青島 266100)

巖藻聚糖硫酸酯是存在于褐藻中的一種水溶性雜多糖, 其主要成分除了 L-巖藻糖和硫酸根外, 還含有半乳糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、糖醛酸、蛋白質(zhì)[1-2]等。研究表明, 巖藻聚糖硫酸酯具有廣泛的生理活性, 如具有抗氧化[3]、抗凝血[3-4]、抗病毒[5]、抗腫瘤[6]、降血脂[7]、抗癌[8-9]、調(diào)節(jié)免疫[10]等作用, 具有廣闊的保健品、藥品開發(fā)前景。

海帶廢渣是工業(yè)上用海帶提取碘、甘露醇、褐藻酸鈉后剩余的殘渣, 研究其成分發(fā)現(xiàn),其中含有的營養(yǎng)物質(zhì)相當于原海帶干重的 70%左右[11], 除了含有粗纖維素、蛋白質(zhì)、多糖、礦物質(zhì)和微量元素等, 還含有相當含量價值極高的巖藻聚糖硫酸酯。但大量的海帶廢渣因成分復雜, 且廣泛存在于生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的廢水中, 難以處置和開發(fā), 故隨著生產(chǎn)的完成作為廢棄物排放, 不僅浪費其大量的有效成分,還帶來一系列環(huán)境污染問題。

目前提取巖藻聚糖硫酸酯的原料大多為新鮮海帶[1,12-13], 但以海帶廢渣為原料提取巖藻聚糖硫酸酯還未見報道。海帶廢渣雜質(zhì)較多, 含較多褐藻膠,褐藻膠遇水膨脹, 使海帶廢渣在水溶液中吸水膨脹,從而吸附大量提取溶劑。此外, 大量褐藻膠的存在也給后期巖藻聚糖硫酸酯的純化帶來困難, 使提取更加復雜和不易實施, 影響巖藻聚糖硫酸酯實際提取率。CaCl2可與褐藻膠生成不易膨脹的褐藻酸鈣, 從而抑制海帶膨脹[14]。本文采用氯化鈣水提法從海帶廢渣中提取巖藻聚糖硫酸酯, 并采用響應面分析法(response surface methodology, RSM)[15-21], 利用合理的試驗設(shè)計, 采用多元二次回歸方程擬合因素與響應值之間的函數(shù)關(guān)系, 通過對回歸方程的分析來尋求最佳提取參數(shù), 并以響應面分析對提取參數(shù)進行優(yōu)化, 解決了提取參數(shù)多變量的問題, 獲得了最佳提取參數(shù)以及較高的提取率。

1 材料、儀器與試劑

海帶廢渣(采自日照結(jié)晶集團), 清洗去除表面雜質(zhì), 50℃烘箱中干燥至恒重后粉碎, 過 100目篩備用。

電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏試驗設(shè)備有限公司); 數(shù)顯恒溫水浴鍋 HH-4(國華電器有限公司)萬能粉碎機; Unico UV-2000分光光度計(尤尼科(上海)儀器有限公司); SC-3610低速離心機(安徽中科中佳科學儀器有限公司); RE-2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠); 冷凍干燥機(北京松源華興科技發(fā)展有限公司)。所用試劑均為國產(chǎn)分析純。

95%乙醇; K2SO4、BaCl2、明膠、濃鹽酸; L-半胱氨酸鹽酸鹽、濃硫酸以上試劑均為國產(chǎn)分析純。L-巖藻糖(Sigma)。

2 試驗方法

2.1 提取工藝

稱取 5 g海帶廢渣粉, 以不同料液比(g/mL)(1%CaCl2)加入水混勻, 在不同條件下提取多糖。操作完畢后離心, 取上清液抽濾, 濾液減壓濃縮, 后加入95%乙醇至其終體積分數(shù)為30%, 靜置1 h, 離心去褐藻膠, 上清液加入 95%乙醇至其終體積分數(shù)為70%, 離心收集巖藻多糖粗沉淀。用無水乙醇洗滌沉淀, 冷凍干燥得粗品。稱重并計算得率。

2.2 單因素試驗

選取提取溫度、提取時間、料液比這三個對巖藻聚糖硫酸酯提取率有顯著影響的因素, 以提取率為考察指標, 得出較佳的單因素水平進行響應面試驗。參考以往文獻, 設(shè)提取溫度 6個水平, 分別為40, 50, 60, 70, 80, 90℃。其他試驗條件一致:V用水體積/W干粉重量=40, 提取時間4 h; 提取時間6個水平, 分別為 2, 3, 4, 5, 6, 7 h。其他試驗條件一致:V用水體積/W干粉重量=40, 溫度為 70℃; 料液比 6個水平, 分別為1∶30, 1∶40, 1∶50, 1∶60, 1∶70, 1∶80。其他試驗條件一致: 提取時間4 h, 溫度為70℃。

2.3 響應面法優(yōu)化提取工藝

根據(jù) Box-Behnken試驗設(shè)計原理, 綜合單因素試驗結(jié)果, 選取提取溫度、提取時間、料液比3因素進行響應面優(yōu)化試驗, 采用Design-Expert8.0軟件進行回歸分析。響應面試驗的因素和水平編碼值見表1。

表1 響應面分析因素與水平Tab. 1 Factors and Levels of response surface analysis

2.4 分析方法

2.4.1 巖藻糖含量測定(半胱氨酸鹽酸鹽法[22]):

以 L-巖藻糖為標準糖繪制標準曲線, 標準曲線y=0.0019x+0.0015,R2=0.9985。

樣品含量測定: 取配制的0.1%樣品溶液0.2 mL,按標準糖的方法測定其吸光度, 通過標準曲線方程計算其巖藻糖含量。

2.4.2 硫酸根含量測定——明膠氯化鋇比濁法[23]

以硫酸鉀為標準品繪制標準曲線, 標準曲線:y=2.6728x+0.0075,R2=0.9962。

樣品含量測定: 取一定量樣品放入安瓿瓶中,加2 mol/LHCl 8 mL, 待樣品溶脹后, 封管, 在水浴鍋中加熱4 h, 取出冷至室溫。把樣品從安瓿瓶中取出, 用蒸餾水慢慢少量沖洗, 定容至25 mL。濾紙過濾, 取1 mL按標準品方法測其吸光度, 通過標準曲線方程計算其巖藻糖含量。

2.5 數(shù)據(jù)處理

本試驗利用統(tǒng)計分析軟件Design-Expert8.0進行試驗設(shè)計和數(shù)據(jù)分析, 每組試驗重復 3次, 結(jié)果以平均值±標準偏差表示。

3 結(jié)果與討論

3.1 單因素試驗結(jié)果

3.1.1 提取溫度對巖藻聚糖硫酸酯提取率的影響

固定料液比 1∶40, 分別在提取溫度為 40～90℃下提取4 h, 提取溫度對提取率的影響見圖1。

圖1 溫度對巖藻聚糖硫酸酯提取率的影響Fig. 1 The effect of extraction temperature on fucoidan yield

由圖 1可知, 當溫度由 40～70℃時, 巖藻聚糖硫酸酯提取率迅速上升, 最高達到 2.3%; 但當溫度繼續(xù)升高, 在70～90℃時, 得率反而下降?？赡茈S著溫度的升高, 巖藻聚糖硫酸酯發(fā)生降解, 導致得率有所下降。

3.1.2 提取時間對巖藻聚糖硫酸酯提取率的影響

固定提取溫度為70℃, 料液比1∶40, 分別提取2～7 h, 提取時間對提取率的影響見圖2。

由圖2可知, 當提取時間由2 h延長至5 h, 巖藻聚糖硫酸酯提取率不斷升高, 最高達到2.37%; 但當提取時間繼續(xù)延長至7 h時, 提取率呈現(xiàn)下降趨勢。這可能是由于提取時間過長導致多糖部分降解。

圖2 時間對巖藻聚糖硫酸酯提取率的影響Fig. 2 The effect of extraction time on fucoidan yield

3.1.3 料液比對巖藻聚糖硫酸酯提取率的影響

固定提取溫度為70℃, 提取時間為4 h, 料液比分別為 1∶30～1∶80, 料液比對提取率的影響見圖3。

由圖3可知, 隨著料液比的增加, 巖藻聚糖硫酸酯的提取率不斷升高, 當料液比為1∶80時, 提取率達到最高3.41%, 但當料液比從1∶70增長到1∶80時, 提取率上升趨于平緩。考慮生產(chǎn)成本, 料液比不宜再增加。

圖3 料液比對巖藻聚糖硫酸酯提取率的影響Fig. 3 The effect of material/liquid ratio on fucoidan yield

3.2 響應面法優(yōu)化巖藻聚糖硫酸酯提取工藝條件

3.2.1 響應面試驗設(shè)計與結(jié)果

根據(jù) Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計原理, 設(shè)計了3因素3水平的響應面分析試驗。共有17個試驗點, 其中 12個分析點, 5個為零點以評估試驗誤差。巖藻聚糖硫酸酯得率為響應值。Box-Behnken試驗設(shè)計和結(jié)果見表2。

表2 響應面分析試驗設(shè)計及結(jié)果Tab. 2 Experimental design for response surface analysis and corresponding experimental data

利用Design-Expert8.0統(tǒng)計軟件, 對表2中提取率試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合, 獲得巖藻聚糖硫酸酯提取率對編碼自變量提取溫度、提取時間和料液比的二次多項回歸方程。根據(jù)試驗結(jié)果建立的數(shù)學模型為:Y=3.40+0.23A+0.15B+0.34C-0.15AB-0.16AC+0.035BC-0.18A2-0.010B2+9.500E-003C2。

3.2.2 回歸模型方差分析

利用Design-Expert8.0統(tǒng)計軟件對回歸模型進行方差分析, 結(jié)果如表3所示。

由表3可知, 模型具有高度顯著性。失擬項表示模型預測值與實際值不擬合的概率, 表 3中失擬項不顯著, 表明模型選擇合適。同時, 軟件分析得到模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.9570, 相關(guān)度較好。變異系數(shù)(CV)反映模型的置信度, CV 值越低, 模型的置信度越高, 本試驗的 CV為 3.35%, 表明此模型擬合度和可信度均較高, 方差分析表明預測值和實測值之間具有高度相關(guān)性, 因此能用此模型對巖藻聚糖硫酸酯提取率進行分析和預測。從表3還可以看出, 對提取率影響的大小依次為料液比(C)、溫度(A)、時間(B)。溫度和時間(AB)、溫度和料液比(AC)交互作用顯著。

表3 回歸模型的方差分析Tab. 3 Variance analysis of the regression model

3.2.3 響應曲面分析

RSM 方法的圖形是特定的響應面(Y)與對應的因素構(gòu)成的一個三維空間在二維平面上的等高圖,每個響應面對其中兩個因素進行分析, 另外兩個因素固定在零水平。從中可以直觀地反映各因素對響應值的影響, 從試驗所得的響應面分析圖上可以找到它們在提取過程中的相互作用將建立的回歸模型中的任意兩個因素固定在零水平, 得到另外兩因素的交互影響, 二次回歸方程的響應面及其等高線圖,見圖4。

圖4直觀地反映了各因素及交互作用對響應值的影響, 比較圖4中6個圖可以看出: 提取溫度、提取時間和料液比與巖藻聚糖硫酸酯得率存在顯著的相關(guān)性。提取溫度與提取時間(AB), 提取溫度與料液比(AC)對巖藻聚糖硫酸酯提取率的交互效應較顯著,表現(xiàn)為曲線較陡; 而提取溫度與料液比(BC)對巖藻聚糖硫酸酯提取率的交互作用不顯著, 表現(xiàn)為曲線較平滑。

3.2.4 巖藻聚糖硫酸酯最佳提取條件的確定與驗證試驗

在選取的各因素范圍內(nèi), 根據(jù)回歸模型通過Design-Expert 8.0軟件分析得出巖藻聚糖硫酸酯最佳提取條件為: 提取溫度68℃, 提取時間6 h, 料液比1∶80。在此條件下軟件基于回歸模型預測提取率為3.83%。

按照優(yōu)化試驗方案進行驗證試驗, 重復3次, 取平均值, 實測巖藻聚糖硫酸酯得率為(3.95±0.065)%,與軟件預測值相對誤差為 0.0304, 說明所選模型合適, 優(yōu)選的提取工藝適合巖藻聚糖硫酸酯的提取。巖藻聚糖硫酸酯粗品中巖藻糖含量為(17.47±0.022)%,硫酸根含量為(37.14±0.025)%。

4 結(jié)論

圖4 各因素交互作用對巖藻聚糖硫酸酯提取率影響的響應面圖及等高線圖Fig. 4 Response surface and contour plots showing the interactions of the extraction conditions

試驗以海帶廢渣為原料, 在單因素試驗的基礎(chǔ)上, 利用響應面建立了二次多項數(shù)學模型回歸方程:Y=3.40+0.23A+0.15.15B+0.34C-0.15AB-0.16AC+0.035BC-0.18A2-0.010B2+9.5×10-3C2。該方程擬合度較高, 能較好地預測巖藻聚糖硫酸酯提取率隨各參數(shù)變化的規(guī)律?；貧w模型方差分析得到溫度、時間、料液比對提取率有極顯著影響, 并且溫度和時間、溫度和料液比的交互作用影響很大。利用響應面曲面及其等高線分析方法對巖藻聚糖硫酸酯提取工藝進行優(yōu)化, 得到優(yōu)化工藝參數(shù): 提取溫度 68℃,提取時間6 h, 料液比1∶80。模型預測優(yōu)化工藝獲取巖藻聚糖硫酸酯提取率的預測值 3.83%, 通過試驗驗證, 實際提取率為3.95%。粗品中巖藻糖含量為17.47%, 硫酸根含量為 37.14%。因此本文從海帶廢渣中提取巖藻聚糖硫酸酯, 與以往從海帶或其他藻類中提取相比較[2,4,9,24], 成本低廉, 且對海帶廢渣的利用具有一定意義。

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