張祥勝,張玉輝,戴翠娥,許德軍

（1.鹽城師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,江蘇鹽城224002；2.河南科技學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453003）

鼠李糖脂主要是由銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）在好氧條件下產(chǎn)生,是目前研究最多的一種生物表面活性劑.與化學(xué)合成的表面活性劑相比,它除具有降低表面張力、穩(wěn)定乳化液和發(fā)泡等相同特性外,還具有一般化學(xué)合成表面活性劑所不具備的無毒、易生物降解等特性,有利于環(huán)境保護.因此它在石油開采業(yè)、食品工業(yè)、環(huán)境生物修復(fù)以及農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用前景得到了廣泛的認可[1-3].快速測定發(fā)酵液中鼠李糖脂的含量是篩選高產(chǎn)菌株的基礎(chǔ).

糖脂類表面活性劑含量的測定方法已有較多報道[4-7],多采用苯酚-硫酸法、苔黑酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法等方法測定,其中苯酚-硫酸法較為常用[6].筆者采用這3種方法測定鼠李糖脂含量,并通過比較其精確度確定最佳方法,為下一步便捷、準確的篩選打下基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 儀器 雙光束紫外可見分光光度計,紫外分光光度計（上海天普分析儀器有限公司）；AL204型電子天平（梅特勒—托利多儀器有限公司）.

1.1.2 藥品 苯酚、硫酸、苔黑酚、蒽酮均為國產(chǎn)分析純,鼠李糖脂樣品購自浙江湖州紫金生物技術(shù)有限公司.

1.2 試驗方法

1.2.1 試劑的配制

鼠李糖脂溶液的制備：稱取干燥恒重的鼠李糖脂1.25 g放置于小燒杯中,用50 mL甲醇溶解,靜置一段時間后取其上清液,用甲醇定容于50 mL量瓶中,將小燒杯及杯中剩余的鼠李糖脂烘至恒重,配制成質(zhì)量濃度為15 g/L的鼠李糖脂母液.

苯酚試劑的配制：苯酚用水浴加熱后溶解,稱取100 g,加鋁片0.10 g,氫氧化鈉0.05 g,蒸餾收集182℃的餾分.取餾出液5.00 g,加水100 mL,置于棕色瓶中,備用.

苔黑酚試劑的配制：取0.19 g苔黑酚溶解于100 mL體積分數(shù)為53%的硫酸中,置于棕色瓶中,備用.蒽酮試劑的配制：取0.20 g蒽酮溶解于100 mL體積分數(shù)為85%的硫酸中,置于棕色瓶中,備用.

1.2.2 測定方法

苯酚-硫酸法：將鼠李糖脂母液用甲醇分別稀釋200倍、160倍、100倍、80倍、40倍,用容量瓶定容,即質(zhì)量濃度分別為75、93.75、150、187.5、375 mg/L.分別取2 mL各濃度的溶液于相對應(yīng)的試管中,將試管置于沸水浴中使甲醇完全蒸發(fā),各試管補去離子水至2 mL,空白對照補水至2 mL,每個試管加1mL質(zhì)量分數(shù)為5%的苯酚試劑,充分振蕩后沸水浴15 min.用自來水冷卻至室溫,在雙光束紫外可見分光光度計中掃描,得到其吸收峰λ=479 nm.使用紫外分光光度計在λ=479 nm處測各濃度的吸光度,并記錄.

苔黑酚-硫酸法：取鼠李糖脂的質(zhì)量濃度梯度為50、100、150、200、250 mg/L.按每200 μL鼠李糖脂溶液加1.8 mL苔黑酚試劑,空白補去離子水至所加樣液量.充分振蕩后沸水浴15 min.用自來水冷卻至室溫,在雙光束紫外可見分光光度計中掃描,得到其吸收峰λ=421 nm.使用紫外分光光度計在λ=421 nm處測各濃度的吸光度,并記錄.

蒽酮-硫酸法：將鼠李糖脂母液用甲醇分別稀釋200倍、100倍、40倍、20倍、10倍,用容量瓶定容,即質(zhì)量濃度分別為75、150、375、750、1 500 mg/L.分別取1 mL樣液至對應(yīng)的試管中,置于水浴中,使甲醇完全蒸發(fā),加4 mL蒽酮試劑,于冰水浴中加1 mL去離子水,空白加蒽酮試劑后于冰水浴中加去離子水.用自來水冷卻至室溫,在雙光束紫外可見分光光度計中掃描,得到其吸收峰λ=586 nm.使用紫外分光光度計在λ=586 nm處測各濃度的吸光度,并記錄.

2 結(jié)果與分析

2.1 鼠李糖脂標準曲線的繪制

2.1.1 苯酚-硫酸法 以吸光度值為縱坐標,鼠李糖脂質(zhì)量濃度為橫坐標,做回歸處理[8],繪制標準曲線（見圖1）,線性回歸得鼠李糖脂的標準曲線方程Y=0.003 64X-0.096 07,相關(guān)系數(shù)R2=0.991.

圖1 苯酚-硫酸法測定鼠李糖脂濃度的標準曲線Fig.1 Standard curve of rhamnolipid measuring by phenol-sulfuric acid method

2.1.2 苔黑酚-硫酸法 以吸光度值為縱坐標,鼠李糖脂質(zhì)量濃度為橫坐標,繪制標準曲線（見圖2）,線性回歸得鼠李糖脂的標準曲線方程Y=0.003 27X+0.016 38,相關(guān)系數(shù)R2=0.998 88.

圖2 苔黑酚-硫酸法測定鼠李糖脂濃度的標準曲線Fig.2 Standard curve of rhamnolipid measuring by orcinol-sulfuric acid method

2.1.3 蒽酮-硫酸法 以吸光度值為縱坐標,鼠李糖脂質(zhì)量濃度為橫坐標,繪制標準曲線（見圖3）,線性回歸得鼠李糖脂的標準曲線方程Y=0.001 01X+0.003 62,相關(guān)系數(shù)R2=0.996 86.

圖3 蒽酮-硫酸法測定鼠李糖脂濃度的標準曲線Fig.3 Standard curve of rhamnolipid measuring by anthrone-sulfuric acid method

2.2 3種方法精確度的比較

隨機取幾個鼠李糖脂的濃度,用上述3種方法測定,使其吸光度值在1.5以內(nèi),以保證在線性范圍內(nèi).將各自的吸光度值代入相應(yīng)的線性關(guān)系曲線,得出鼠李糖脂的含量與配制的濃度進行比較,得出精確度較高的方法.3種方法精確度的比較見表1.

表1 3種方法精確度的比較Tab.1 The comparison of accuracy of three methods

由表1可知,3種測定方法中以蒽酮-硫酸法的精確度最好.

3 結(jié)論

鼠李糖脂作為生物表面活性劑在生產(chǎn)生活中已經(jīng)受到很大的關(guān)注,并逐漸應(yīng)用于實踐,探求簡單便捷的測鼠李糖脂濃度的方法已成為重要的研究內(nèi)容.對鼠李糖脂含量測定方法的研究很多,苯酚-硫酸法是一般實驗室常選用的方法,其技術(shù)和原理都已經(jīng)很成熟.齊香君等[9]的研究表明蒽酮-硫酸法具有更高的精確度和可信度.本試驗用蒽酮-硫酸法、苯酚-硫酸法和苔黑酚-硫酸法測定了鼠李糖脂的含量,結(jié)果也表明在對鼠李糖脂進行定量分析時,蒽酮-硫酸法優(yōu)于苯酚-硫酸法和苔黑酚-硫酸法.

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[2]Mulligan C N,Yong R N,Gibbs B F.Remediation technologies for metal-contaminated soils and groundwater：an evaluation[J].Engineering Geology,2001,60（1/4）：193-207.

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[9]齊香君,徐婷婷.定量測定銅綠假單孢菌發(fā)酵液中鼠李糖脂的方法學(xué)研究[J].陜西科技大學(xué)學(xué)報,2010,28（6）：39-42.