鞏志金，彭彥峰，張煜婷，宋國(guó)田，陳五九，賈士儒，王欽宏

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產(chǎn)鼠李糖脂生物表面活性劑大腸桿菌的構(gòu)建與優(yōu)化

鞏志金1,2，彭彥峰2，張煜婷2，宋國(guó)田1,2，陳五九2，賈士儒1，王欽宏2

1 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457 2 中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所 中國(guó)科學(xué)院系統(tǒng)微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300308

鞏志金, 彭彥峰, 張煜婷, 等. 產(chǎn)鼠李糖脂生物表面活性劑大腸桿菌的構(gòu)建與優(yōu)化. 生物工程學(xué)報(bào), 2015, 31(7): 1050–1062.Gong ZJ, Peng YF, Zhang YT, et al. Construction and optimization of Escherichia coli for producing rhamnolipid biosurfactant. Chin J Biotech, 2015, 31(7): 1050–1062.

目前鼠李糖脂生物表面活性劑主要由條件致病的銅綠假單胞菌生產(chǎn)獲得，從而影響工業(yè)應(yīng)用。為了開(kāi)發(fā)一種相對(duì)安全的鼠李糖脂生產(chǎn)菌，將帶有不同強(qiáng)度組成型合成啟動(dòng)子的鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶基因 (Rhamnosyltransferase gene,) 以單、中、高3種拷貝數(shù)分別在大腸桿菌ATCC 8739中異源表達(dá)，實(shí)現(xiàn)了不同產(chǎn)量的鼠李糖脂異源合成。對(duì)基因和基因簇 (TDP-L-鼠李糖合成的基因簇) 進(jìn)一步利用合成啟動(dòng)子進(jìn)行組合調(diào)控，篩選獲得了最優(yōu)生產(chǎn)鼠李糖脂工程菌——大腸桿菌TIB-RAB226。對(duì)大腸桿菌TIB-RAB226進(jìn)行發(fā)酵溫度優(yōu)化，鼠李糖脂產(chǎn)量達(dá)到124.3 mg/L，是優(yōu)化前的1.17倍。通過(guò)分批補(bǔ)料發(fā)酵，12 h時(shí)鼠李糖脂產(chǎn)量達(dá)到209.2 mg/L。對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析，共檢出相對(duì)含量變化的5類質(zhì)核比不同的鼠李糖脂同系物。本研究可為異源合成產(chǎn)鼠李糖脂提供重要參考。

鼠李糖脂，鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶，基因簇，組成型合成啟動(dòng)子，組合調(diào)控，大腸桿菌

鼠李糖脂是一種由多種同族結(jié)構(gòu)組成的陰離子生物表面活性劑，其親水基團(tuán)一般由1?2分子的鼠李糖環(huán)構(gòu)成，疏水基團(tuán)則由不同碳鏈的β-羥基烷酸構(gòu)成，分子式可表述為Rhl-Cx、Rhl-Cx-Cy、Rhl-Rhl-Cx或Rhl-Rhl-Cx-Cy (Rhl為鼠李糖；x、y通常為8–14)[1]。鼠李糖脂能顯著降低流動(dòng)相之間的界面張力，具有優(yōu)良的去垢、乳化和絮凝能力，并且無(wú)毒及可生物降解，在采油工業(yè)、化妝品、環(huán)境修復(fù)中具有巨大的應(yīng)用潛力[2]。另外，通過(guò)微生物發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂并水解得到鼠李糖，有望替代天然植物中提取獲得的鼠李糖，成為食用型甜味劑鼠李糖的潛在來(lái)源[3]。

目前，工業(yè)上主要采用銅綠假單胞菌發(fā)酵法生產(chǎn)鼠李糖脂[4]，而銅綠假單胞菌(俗稱綠膿桿菌) 被認(rèn)為是三種最強(qiáng)人類條件致病菌之一，限制了其在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用[5]。因此，人們期望利用相對(duì)安全的工業(yè)微生物進(jìn)行鼠李糖脂的生產(chǎn)，降低其在生產(chǎn)中的潛在危害，拓展相關(guān)產(chǎn)品的應(yīng)用范圍[6]。如利用伯克氏菌[7]、綠針假單胞菌[8]等非條件致病菌生產(chǎn)鼠李糖脂，但由于這些微生物遺傳背景相對(duì)不清晰且缺乏簡(jiǎn)便的遺傳操技術(shù)，很難進(jìn)一步提高鼠李糖脂的產(chǎn)量，無(wú)法滿足生產(chǎn)要求。而大腸桿菌作為一種遺傳背景清晰、技術(shù)操作成熟、工業(yè)應(yīng)用廣泛的模式生物，具有完整的TDP-L-鼠李糖和β-羥基烷酸 (HAAs)合成途徑 (圖1)，被認(rèn)為是更具改造潛力的良好宿主菌。Wang等利用轉(zhuǎn)座體介導(dǎo)的染色體整合的方法，將合成鼠李糖脂的關(guān)鍵基因整合入大腸桿菌BL21 (DE3) 基因組，并成功進(jìn)行異源表達(dá)，在IPTG的誘導(dǎo)下生產(chǎn)鼠李糖脂，產(chǎn)量達(dá)到約 80 mg/L[9]。Cabrera-Valladares等將基因?qū)氪竽c桿菌W3110未得到鼠李糖脂，將基因和(銅綠假單胞菌鼠李糖合成基因簇) 基因簇一起導(dǎo)入時(shí)，鼠李糖脂產(chǎn)量達(dá)到120.6 mg/L，證明了TDP-L-鼠李糖是鼠李糖脂異源生產(chǎn)的一個(gè)主要影響因素[10]。雖然鼠李糖脂在大腸桿菌中生產(chǎn)取得了一定程度的成功，但由于其前體物質(zhì)主要來(lái)自大腸桿菌的核心代謝途徑 (圖1)，導(dǎo)致細(xì)胞不易于過(guò)量生產(chǎn)鼠李糖脂[5,11]。因此，需要通過(guò)代謝工程的策略進(jìn)一步提高其前體物的表達(dá)量和平衡代謝流量，提高鼠李糖脂的產(chǎn)量[12]。

本研究中我們構(gòu)建了產(chǎn)鼠李糖脂的大腸桿菌，并利用組成型合成啟動(dòng)子對(duì)相應(yīng)的關(guān)鍵基因進(jìn)行了組合調(diào)控，鼠李糖脂產(chǎn)量得到較大提高，而且不用誘導(dǎo)表達(dá)，避免使用相對(duì)昂貴的誘導(dǎo)劑。研究首先將鼠李糖脂合成的關(guān)鍵基因在ATCC 8739中進(jìn)行表達(dá)優(yōu)化，然后利用合成啟動(dòng)子與基因簇進(jìn)行組合調(diào)控，得到最優(yōu)鼠李糖脂生產(chǎn)菌TIB-RAB226。最后，對(duì)工程菌TIB-RAB226進(jìn)行了發(fā)酵溫度的優(yōu)化和分批補(bǔ)料發(fā)酵，進(jìn)一步提高了鼠李糖脂的產(chǎn)量。對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用 (LC-MS) 技術(shù)分析，發(fā)現(xiàn)工程大腸桿菌產(chǎn)生的鼠李糖脂含有多種不同類型和相對(duì)豐度的鼠李糖脂同系物 (Congener)。

圖1 工程大腸桿菌鼠李糖脂生物合成途徑

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

TIB-R02基因組DNA用作克隆基因的模板。ATCC 8739是構(gòu)建產(chǎn)鼠李糖脂大腸桿菌的出發(fā)菌株。本研究所用菌株如表1所示。

1.1.2 主要試劑

氨芐青霉素、氯霉素、硫酸卡那霉素購(gòu)自上海生工生物工程服務(wù)有限公司；質(zhì)粒小量快速提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Axygen 公司；DNA 回收試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)公司；TransStart Fast Pfu DNA 聚合酶、DNA marker、pEASY-Blunt Zero Cloning Kit試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶、T4 多聚核苷酸激酶購(gòu)自NEB公司；蘇丹紅II、液體石蠟油、鼠李糖標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為分析純。

表1 本研究的菌株

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基

每升LB培養(yǎng)基包括10 g胰蛋白胨, 5 g酵母提取物和10 g氯化鈉 (固體LB加入1.5%的瓊脂粉)；鼠李糖脂發(fā)酵培養(yǎng)基為添加氨芐青霉素、硫酸卡那霉素和后期補(bǔ)加1%() 葡萄糖的LB 培養(yǎng)基；氨芐青霉素、硫酸卡那霉素、氯霉素終濃度分別為100 μg/mL、50 μg/mL和34 μg/mL。

1.2.2 鼠李糖脂檢測(cè)

采用排油圈法[13]對(duì)鼠李糖脂含量進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)方法簡(jiǎn)單改進(jìn)。玻璃平皿 (D=9 cm) 中加入25 mL的液體LB，液面穩(wěn)定后加入1 mL蘇丹紅Ⅱ染紅的液體石蠟。待石蠟鋪開(kāi)至半徑為20 mm時(shí)，加入10 μL鼠李糖脂發(fā)酵液并記錄最大排油圈半徑。根據(jù)排油圈半徑(mm) 與鼠李糖脂濃度(g/L) 之間的線性關(guān)系=0.097 4+ 0.12，計(jì)算發(fā)酵液中鼠李糖脂的含量。本實(shí)驗(yàn)所使用的排油圈法已經(jīng)與苔黑酚-濃硫酸顯色法[9]進(jìn)行對(duì)比驗(yàn)證，兩種方法結(jié)果一致。

1.2.3 質(zhì)粒及重組片段的構(gòu)建

本研究所使用的質(zhì)粒、引物分別見(jiàn)表2和表3。分別構(gòu)建含不同表達(dá)強(qiáng)度組成型合成啟動(dòng)子的高拷貝數(shù)質(zhì)粒pEASY-XRhlAB (X代表P164、P230和P346 3種低、中、高不同表達(dá)強(qiáng)度的組成型啟動(dòng)子，啟動(dòng)子序列見(jiàn)表3[14]) 和中等拷貝數(shù)質(zhì)粒pET-XRhlAB，作為鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶基因的質(zhì)粒表達(dá)載體，構(gòu)建方法如下：1) pEASY-XRhlAB質(zhì)粒的構(gòu)建：以TIB-R02基因組DNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得帶有不同表達(dá)強(qiáng)度組成型啟動(dòng)子的XRhlAB DNA片段 (分別以P164A-5/T7tB-3，P230A-5/ T7tB-3和P346A-5/T7tB-3為引物對(duì))。將純化后的XRhlAB DNA片段與pEASY-Blunt Zero連接后得到pEASY-XRhlAB表達(dá)載體。2) pET-XRhlAB質(zhì)粒的構(gòu)建：以pEASY-XRhlAB為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得帶有HⅠ和RⅠ酶切位點(diǎn)的XRhlAB基因片段，與pET-30a(+) 載體一起經(jīng)酶切、連接后得到pET-XRhlAB表達(dá)載體。

整合到基因組中的XRhlAB DNA片段構(gòu)建如下：用上述相同方法獲得XRhlAB片段，將XRhlAB片段純化、磷酸化處理后與pEASY-ap (帶有兩端各500 bp同源臂序列質(zhì)粒) 質(zhì)粒連接獲得帶有500 bp同源臂的質(zhì)粒pEASY-XRhlAB-ap。以pEASY-XRhlAB-ap和pEASY-cat-SacB-ap (兩端各帶有500 bp同源臂序列，同源臂之間含有抗性基因簇的質(zhì)粒) 為模板，用引物P1和P2分別擴(kuò)增獲得帶同源臂XRhlAB-ap和cat-SacB-ap的DNA片段。cat-SacB-ap、XRhlAB-ap DNA片段分別用于第一步和第二步同源重組的片段，將XRhlAB DNA片段整合進(jìn)大腸桿菌基因組，代替基因。

用于基因簇啟動(dòng)子替換的片段構(gòu)建如下：以質(zhì)粒pEASY-cat-SacB-ap為模板利用引物Sens-cat-Sacb/Anti-cat-Sacb 進(jìn)行擴(kuò)增，獲得帶有50 bp同源臂的rha-cat-SacB DNA片段，用于第一步同源重組。直接通過(guò)基因合成帶有上述不同組成型啟動(dòng)子和50 bp同源臂的P164-rha、P230-rha和P346-rha片段用于第二步同源重組。

1.2.4 工程菌的構(gòu)建

將pET-XRhlAB質(zhì)粒轉(zhuǎn)入ATCC 8739得到3種中等拷貝數(shù)質(zhì)粒表達(dá)基因的工程菌PET164、PET230、PET346；將pEASY-XRhlAB質(zhì)粒轉(zhuǎn)入ATCC 8739得到3種高拷貝數(shù)質(zhì)粒表達(dá)基因的工程菌PSY164、PSY230、PSY346；另外，通過(guò)兩步同源重組的方法[16-17]將XRhlAB DNA片段整合到ATCC 8739基因組替換基因，得到3株以單拷貝數(shù)表達(dá)基因的工程菌PGE164、PGE230和PGE346。上述9株菌用于基因異源表達(dá)合成鼠李糖脂的研究。

表2 本研究所用的質(zhì)粒

將ATCC 8739基因組中基因簇的原始啟動(dòng)子用上述不同強(qiáng)度的啟動(dòng)子替換，構(gòu)建以不同強(qiáng)度表達(dá)基因簇的工程菌Rha-164、Rha-230及Rha-346。將質(zhì)粒pET- 164RhlAB、pET-230RhlAB 及pET-346RhlAB分別導(dǎo)入菌株Rha-164、Rha-230及Rha-346，得到9種組合菌株(Rha164-RAB164、Rha164- RAB230、Rha164-RAB346、Rha230-RAB164、Rha230-RAB230、Rha230-RAB346、Rha346- RAB164、Rha346-RAB230和Rha346-RAB346)，用于基因和基因簇組合調(diào)控 研究。

1.2.5 工程菌的篩選及發(fā)酵溫度優(yōu)化

將構(gòu)建的工程菌接種于含氨芐青霉素、硫酸卡那霉素的LB試管中，200 r/min、30 ℃培養(yǎng)24 h，通過(guò)鼠李糖脂產(chǎn)量對(duì)菌株進(jìn)行篩選。利用篩選得到的最優(yōu)工程菌TIB-RAB226進(jìn)行發(fā)酵溫度的優(yōu)化，將菌株TIB-RAB226依次接種于溫度為26、28、30、32、34和36 ℃的搖瓶培養(yǎng)基中，200 r/min，培養(yǎng)12 h，檢測(cè)菌體生長(zhǎng)及鼠李糖脂產(chǎn)量確定最優(yōu)的發(fā)酵 溫度。

1.2.6 鼠李糖脂的補(bǔ)料發(fā)酵及產(chǎn)物分析

為了進(jìn)一步提高鼠李糖脂的產(chǎn)量，采用搖瓶補(bǔ)料的方式對(duì)菌株TIB-RAB226進(jìn)行補(bǔ)料發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。將種子液培養(yǎng)至600=3，以5%的接種量接種至LB培養(yǎng)基，28 ℃、 200 r/min培養(yǎng)16 h，每2 h測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)密度、鼠李糖脂產(chǎn)量及pH，并在8 h時(shí)進(jìn)行補(bǔ)加1%葡萄糖補(bǔ)料實(shí)驗(yàn)。將發(fā)酵產(chǎn)物用萃取液 (氯仿：乙醇=2：1) 萃取后吹干有機(jī)溶劑得到鼠李糖脂樣品，用于高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用 (LC-MS) 分析。LC-MS分析方法參照Wang等[9]所用方法并簡(jiǎn)單修改，色譜柱為Genmini C18柱 (100 mm×3.0 mm, 3 μm)，流動(dòng)相A為水：乙腈=98：2，B為水：乙腈=10：90，A和B中均含1%乙酸。梯度洗脫條件為0?1 min，8%；1?51 min，60%；51?61 min，60%；61?62 min，8%；62?67 min，8%。流速為0.5 mL/min，進(jìn)樣體積為10 μL。質(zhì)譜條件：對(duì)鼠李糖脂樣品采用陰離子模式，電噴霧毛細(xì)管噴口電離電壓4.2 kV，霧化氣和干燥氣均為氮?dú)?，噴霧氣壓力為1.0 Pa，干燥氣溫度180 ℃、流速為5.0 L/min，質(zhì)譜掃描范圍為100?1 000 (m/z)。

表3 本研究所用的引物

The underlined is the sequence of synthetic promoter corresponding to the primer name.

2 結(jié)果與分析

2.1 rhlAB基因的異源表達(dá)合成鼠李糖脂

基因編碼的鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶既能夠催化生成β-羥基烷酸 (HAAs)，又能將HAAs 與TDP-L-鼠李糖結(jié)合生成鼠李糖脂，是生產(chǎn)鼠李糖脂的關(guān)鍵酶 (圖1)。同時(shí)，基因的拷貝數(shù)和啟動(dòng)子強(qiáng)度是影響工程菌代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的重要因素。本實(shí)驗(yàn)以不同拷貝數(shù)形式表達(dá)帶有3種表達(dá)強(qiáng)度啟動(dòng)子的基因，通過(guò)基因拷貝數(shù)和啟動(dòng)子強(qiáng)度對(duì)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，獲得合適的表達(dá)形式。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，對(duì)照組發(fā)酵液中未檢測(cè)到鼠李糖脂 (數(shù)據(jù)未列出)。不同拷貝數(shù)之間的菌株產(chǎn)量差別明顯；相同拷貝數(shù)之間以不同強(qiáng)度啟動(dòng)子表達(dá)基因的菌株產(chǎn)量差別較小。以上研究表明基因拷貝數(shù)在基因表達(dá)調(diào)控中占主導(dǎo)作用，而啟動(dòng)子強(qiáng)度的影響較小。含中等拷貝數(shù)質(zhì)粒表達(dá)基因的菌株，鼠李糖脂產(chǎn)量明顯高于以單拷貝數(shù)在基因組中表達(dá)基因的菌株和以高貝數(shù)質(zhì)粒表達(dá)基因的菌株，表明中等拷貝數(shù)的pET-30a(+) 質(zhì)粒更適合與不同強(qiáng)度的組成型啟動(dòng)子結(jié)合表達(dá)基因，實(shí)現(xiàn)鼠李糖脂在大腸桿菌中的異源合成。因此，選擇帶不同啟動(dòng)子強(qiáng)度表達(dá)基因的中等拷貝數(shù)質(zhì)粒pET-164RhlAB、pET-230RhlAB和pET-346RhlAB作為基因的表達(dá)載體并進(jìn)行進(jìn)一步的表達(dá)調(diào)控。

2.2 rhlAB基因與rhaBDAC基因簇的啟動(dòng)子組合調(diào)控

基因簇控制表達(dá)的TDP-L-鼠李糖是鼠李糖脂合成的主要前體物質(zhì)和限制因素，本實(shí)驗(yàn)中我們用不同強(qiáng)度啟動(dòng)子表達(dá)基因簇，并將其與帶不同啟動(dòng)子的基因進(jìn)行組合調(diào)控，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，對(duì)照菌株為PET164、PET230及PET346，鼠李糖脂平均產(chǎn)量分別為71、62和56 mg/L。在相同條件下含P230啟動(dòng)子的基因簇分別與pET-164RhlAB、pET-230RhlAB和pET-346RhlAB質(zhì)粒進(jìn)行組合調(diào)控得到的菌株Rha230-RAB164、Rha230-RAB230和Rha230- RAB346鼠李糖脂產(chǎn)量均高于其他組合調(diào)控的菌株，說(shuō)明P230啟動(dòng)子更適合替代基因簇原始啟動(dòng)子與pET-164RhlAB、pET-230RhlAB、pET-346RhlAB質(zhì)粒進(jìn)行基因的組合調(diào)控，來(lái)提高鼠李糖脂的產(chǎn)量。9種組合菌株中Rha230-RAB346的產(chǎn)量最高，達(dá)到 106.6 mg/L。因此，選擇含P230啟動(dòng)子的基因簇和含P346啟動(dòng)子的中等拷貝數(shù)質(zhì)粒pET-346RhlAB的菌株Rha230-RAB346進(jìn)行下一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，并將Rha230-RAB346命名為大腸桿菌TIB-RAB226。

圖2 rhlAB基因以不同形式在大腸桿菌表達(dá)時(shí)鼠李糖脂的產(chǎn)量

圖3 不同強(qiáng)度啟動(dòng)子組合調(diào)控對(duì)大腸桿菌合成鼠李糖脂產(chǎn)量的影響

2.3 產(chǎn)鼠李糖脂大腸桿菌TIB-RAB226發(fā)酵溫度優(yōu)化

雖然宿主、載體和克隆基因是影響重組菌產(chǎn)物合成的主要因素，但是其所處的環(huán)境條件也是一個(gè)不可忽略的因素，尤其是環(huán)境溫度的變化，不僅影響代謝過(guò)程中各種關(guān)鍵酶的活性及副產(chǎn)物的積累，而且還與質(zhì)?？截悢?shù)的變化息息相關(guān)。因此，在發(fā)酵過(guò)程中需要采用一定的溫度控制策略來(lái)改善代謝產(chǎn)物的合成與積累[18]。我們對(duì)大腸桿菌TIB-RAB226的發(fā)酵溫度進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明最適鼠李糖脂生產(chǎn)溫度為28 ℃，鼠李糖脂最高產(chǎn)量可達(dá)到124.3 mg/L (圖4)，與30 ℃相比產(chǎn)量提高1.17倍。當(dāng)溫度進(jìn)一步升高或低于28 ℃時(shí)，鼠李糖脂的產(chǎn)量都逐漸下降，36 ℃時(shí)鼠李糖脂產(chǎn)量下降為 64.1 mg/L，與28 ℃時(shí)最高產(chǎn)量相比下降約46.1%，降幅明顯。

2.4 產(chǎn)鼠李糖脂大腸桿菌TIB-RAB226的分批補(bǔ)料發(fā)酵

為了進(jìn)一步優(yōu)化鼠李糖脂的合成，對(duì)大腸桿菌TIB-RAB226進(jìn)行了分批補(bǔ)料發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，測(cè)定了生產(chǎn)過(guò)程中細(xì)胞密度、鼠李糖脂產(chǎn)量及pH變化情況，結(jié)果如圖5所示。發(fā)酵前8 h菌體在LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，鼠李糖脂產(chǎn)量和菌體生物量同步增加，pH逐漸變堿性。當(dāng)培養(yǎng)至8 h左右細(xì)胞生長(zhǎng)開(kāi)始進(jìn)入穩(wěn)定期，pH由7.0升至8.5，細(xì)胞生長(zhǎng)趨于穩(wěn)定，600=3.47，鼠李糖脂的生產(chǎn)速率減小，產(chǎn)量達(dá)到111.7 mg/L。此時(shí)向培養(yǎng)基中補(bǔ)加1%的葡萄糖并繼續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)。在8?12 h階段鼠李糖脂產(chǎn)量快速增加，在12 h左右鼠李糖脂達(dá)到最高產(chǎn)量209.2 mg/L，是補(bǔ)料前的1.87倍。此時(shí)，由于補(bǔ)加葡萄糖后發(fā)酵液中逐漸積累副產(chǎn)物乙酸導(dǎo)致pH降至6左右，工程菌生長(zhǎng)緩慢并停止合成鼠李糖脂。發(fā)酵至16 h時(shí)細(xì)胞生物量達(dá)到600=10.1，并趨于穩(wěn)定，pH降至5左右，此時(shí)乙酸積累達(dá)到1.7 g/L，導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)基本停止，無(wú)法進(jìn)行進(jìn)一步的補(bǔ)料實(shí)驗(yàn)。因此，要進(jìn)一步改善鼠李糖脂的合成，需要對(duì)工程菌進(jìn)行進(jìn)一步的遺傳改造，阻斷副產(chǎn)物乙酸的合成與積累。

圖4 不同溫度對(duì)工程菌鼠李糖脂合成的影響

圖5 大腸桿菌TIB-RAB226的分批補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)

2.5 LC-MS對(duì)產(chǎn)物中鼠李糖脂的結(jié)構(gòu)分析

對(duì)工程菌生產(chǎn)的鼠李糖脂分離純化進(jìn)行了LC-MS分析，結(jié)果顯示大腸桿菌合成的鼠李糖脂含有5類質(zhì)核比(/) 的鼠李糖脂同系物 (圖6)，其中/為333.1908和503.3215鼠李糖脂分別在30.8 min和61.9 min 被分離，為Rhl-C10和Rhl-C10-C10。另外，/為531.4、475.3、529.3的離子峰分別在34.3、52.4和 55.9 min 被分離，根據(jù)相關(guān)研究結(jié)果[9,19-20]，上述3種離子峰可能是另外3類單鼠李糖脂同系物，且均各含有2種分子量相同的鼠李糖脂同系物，分別為Rhl-C12-C10或Rhl-C10-C12，Rhl-C8-C10或Rhl-C10-C8，Rhl-C10-C12:1或Rhl-C12:1-C10。另外，根據(jù)LC-MS總離子流圖的峰面積，估算該大腸桿菌合成的5類鼠李糖脂同系物的相對(duì)含量如圖6所示，其中Rhl-C10-C12:1或Rhl-C12:1-C10組分的比例最大，相對(duì)豐度達(dá)到約55%。

圖6 大腸桿菌TIB-RAB226合成的鼠李糖脂同系物的相對(duì)含量

3 討論

目前，主要通過(guò)銅綠假單胞菌發(fā)酵法生產(chǎn)鼠李糖脂[4]，但是銅綠假單胞菌較強(qiáng)的條件致病性限制了其在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。人們也嘗試通過(guò)很多非致病微生物來(lái)生產(chǎn)鼠李糖脂[6,21]，而大腸桿菌作為一種“一般認(rèn)為安全 (GRAS)”的模式生物，具有清晰的遺傳背景、成熟的遺傳操作技術(shù)及廣泛的工業(yè)應(yīng)用，是異源合成鼠李糖脂合適的選擇。我們將鼠李糖脂合成的關(guān)鍵基因在ATCC 8739中成功異源表達(dá)，并對(duì)相關(guān)基因利用不同強(qiáng)度的組成型合成啟動(dòng)子進(jìn)行組合調(diào)控，得到一株鼠李糖脂產(chǎn)量較高的大腸桿菌工程菌TIB-RAB226。利用LB培養(yǎng)基并補(bǔ)加1%葡萄糖發(fā)酵，在12 h左右鼠李糖脂產(chǎn)量達(dá)到最高的209.2 mg/L。與之前報(bào)道的利用大腸桿菌產(chǎn)鼠李糖脂的文獻(xiàn)[4-5]相比，鼠李糖脂的產(chǎn)量大幅提高。并且由于利用了組成型合成啟動(dòng)子進(jìn)行關(guān)鍵基因的組合調(diào)控，使得該工程菌在生產(chǎn)鼠李糖脂時(shí)不需要相對(duì)昂貴的IPTG誘導(dǎo)物，為簡(jiǎn)化生產(chǎn)和降低成本奠定了基礎(chǔ)。

基因的拷貝數(shù)是影響基因異源表達(dá)的主要因素[22-23]。在我們的研究中，基因以單拷貝數(shù)形式在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)，鼠李糖脂的產(chǎn)量很低，可能的原因是當(dāng)在基因組中單拷貝數(shù)表達(dá)基因時(shí)產(chǎn)生的鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶較少，導(dǎo)致其催化產(chǎn)生的鼠李糖脂較少。含中等拷貝數(shù)表達(dá)基因的菌株鼠李糖脂產(chǎn)量明顯高于高拷貝數(shù)表達(dá)基因的菌株，推斷一個(gè)可能的原因是以高拷貝數(shù)質(zhì)粒表達(dá)外源基因時(shí)，目的基因表達(dá)量可能不再由質(zhì)粒的拷貝數(shù)決定，而是由轉(zhuǎn)錄和翻譯水平?jīng)Q定，導(dǎo)致拷貝數(shù)與表達(dá)量之間為非正相關(guān)關(guān)系，鼠李糖脂的產(chǎn)量不高。另一個(gè)可能的原因是基因以高拷貝數(shù)在大腸桿菌表達(dá)時(shí)會(huì)增加菌體的代謝負(fù)擔(dān)，導(dǎo)致產(chǎn)率和轉(zhuǎn)化率降低，不利于鼠李糖脂的積累。

在和組合調(diào)控中，與帶中等強(qiáng)度的啟動(dòng)子表達(dá)時(shí)獲得了最高鼠李糖脂產(chǎn)量，這有兩種可能的原因：一、在此組合調(diào)控條件下，TDP-L-鼠李糖的產(chǎn)生與消耗達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，更有利于鼠李糖脂的生產(chǎn)；二、在表達(dá)使用P230啟動(dòng)子合成TDP-L-鼠李糖的量最高，更適應(yīng)合成鼠李糖脂的需要，這些可以通過(guò)分析基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)、前體物TDP-L-鼠李糖和HAA的量等來(lái)進(jìn)一步研究。通過(guò)發(fā)酵溫度的優(yōu)化發(fā)現(xiàn)基因在大腸桿菌表達(dá)實(shí)現(xiàn)鼠李糖脂合成的最適溫度為28 ℃，我們推測(cè)一方面可能是在此溫度下鼠李糖脂合成相關(guān)途徑的代謝流量更加平衡，另一方面可能是鼠李糖脂及其前體合成相關(guān)酶活性提高，更有利于鼠李糖脂的合成。LC-MS分析顯示我們的大腸桿菌 TIB-RAB226合成的均為單鼠李糖脂，這與之前的報(bào)道一致[6,24]，原因是大腸桿菌中缺乏鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶2基因 () 無(wú)法將TDP-L-鼠李糖結(jié)合到單環(huán)鼠李糖脂中形成雙環(huán)的鼠李糖脂。不過(guò)來(lái)自我們的工程大腸桿菌的產(chǎn)物中，其同系物的相對(duì)豐度與Wang等[9]的還有一定的差異，Wang等在發(fā)酵產(chǎn)物中未檢測(cè)到Rhl-C10-C12:1或Rhl-C12:1-C10類型的鼠李糖脂，而Rha-C10-C10類型的鼠李糖脂含量較高，這可能是由出發(fā)宿主菌的不同造成的。

另外，β-羥基烷酸 (HAAs) 的代謝通量也會(huì)直接影響鼠李糖脂的生物合成，是鼠李糖脂合成的另一個(gè)關(guān)鍵前體物質(zhì)，其代謝合成主要受脂肪酸合成途徑 (FAS-II) 和β-氧化途徑的影響[25-26]，我們下一步工作將對(duì)β-羥基烷酸合成途徑中相關(guān)酶進(jìn)行代謝調(diào)控，進(jìn)一步提高大腸桿菌合成鼠李糖脂的能力。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Construction and optimization offor producing rhamnolipid biosurfactant

Zhijin Gong1,2, Yanfeng Peng2, Yuting Zhang2, Guotian Song1,2, Wujiu Chen2, Shiru Jia1, and Qinhong Wang2

1 College of Biotechnology, Tianjin University of Science & Technology, Tianjin 300457, China 2 Key Laboratory of Systems Microbial Biotechnology, Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308, China

Rhamnolipid biosurfactant is mainly produced bythat is the opportunistic pathogenic strain and not suitable for future industrial development. In order to develop a relatively safe microbial strain for the production of rhamnolipid biosurfactant, we constructed engineeredstrains for rhamnolipid production by expressing different copy numbers of rhamnosyltransferase () gene with the constitutive synthetic promoters of different strengths inATCC 8739. We further studied the combinatorial regulation ofgene andgene cluster for dTDP-l-rhamnose biosynthesis with different synthetic promoters, and obtained the best engineered strain—TIB-RAB226. Through the optimization of culture temperature, the titer of rhamnolipd reached 124.3 mg/L, 1.17 fold higher than that under the original condition. Fed-batch fermentation further improved the production of rhamnolipid and the titer reached the highest 209.2 mg/L within 12 h. High performance liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) analysis showed that there are total 5 mono-rhamnolipid congeners with different nuclear mass ratio and relative abundance. This study laid foundation for heterologous biosynthesis of rhanomilipd.

rhamnolipid, rhamnosyltransferase,gene cluster, constitutive synthetic promoter, combinatorial regulation,

November 25, 2014;

January 21, 2015

National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2014AA022104), Industrial Biotechnology Program of Tianjin Municipal Science and Technology Commission (No. 12ZCZDSY13000).

:Yanfeng Peng. Tel/Fax: +86-22-84861950; E-mail: peng_yf@tib.cas.cn Qinhong Wang. Tel/Fax: +86-22-84861950; E-mail: wang_qh@tib.cas.cn

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃) (No. 2014AA022104)，天津市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)工業(yè)生物技術(shù)專項(xiàng) (No. 12ZCZDSY13000)資助。