牛坤，胡逸博，毛健，鄒樹平，鄭裕國

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微粒添加對棘白菌素B發(fā)酵過程的影響

牛坤，胡逸博，毛健，鄒樹平，鄭裕國

浙江工業(yè)大學生物與環(huán)境工程學院，浙江 杭州 310014

牛坤, 胡逸博, 毛健, 等. 微粒添加對棘白菌素B發(fā)酵過程的影響. 生物工程學報, 2015, 31(7): 1082–1088.Niu K, Hu YB, Mao J, et al. Effect of microparticles on echinocandin B production by Aspergillus nidulans. Chin J Biotech, 2015, 31(7): 1082–1088.

阿尼芬凈是一種新型的抗真菌藥物，能夠抑制各種致病念珠菌在活體內外的活性。棘白菌素B (Echinocandin B，ECB) 是合成阿尼芬凈的關鍵前體，其發(fā)酵單位的高低直接關系到阿尼芬凈的價格及市場前景。文中考察了構巢曲霉在搖瓶發(fā)酵生產ECB的過程中，添加滑石粉、Al2O3、玻璃珠等微粒對其發(fā)酵單位的影響。發(fā)現微粒的粒徑和添加濃度是菌體形態(tài)和ECB產量的關鍵影響因素，添加20 g/L滑石粉(d50= 14.2 μm) 和7顆玻璃珠 (d = 6 mm) 可使ECB發(fā)酵產量分別比對照提高33.2%和41.7%，達到1 262.9 mg/L和1 344.1 mg/L。結果表明微粒的添加可以顯著地改善絲狀微生物發(fā)酵過程中的菌絲形態(tài)，提高其產物的發(fā)酵產量，為絲狀微生物發(fā)酵過程的優(yōu)化提供了一種重要手段。

棘白菌素B，構巢曲霉，微粒，發(fā)酵

棘白菌素類抗生素是20世紀70年代發(fā)現的一組天然產物，具有類似的環(huán)狀多肽核心和不同的脂肪酸側鏈，能夠非競爭性地抑制真菌細胞壁β-1,3-葡聚糖合成酶的活性，從而達到抗真菌的目的[1-3]。FDA已批準上市的這類藥物包括卡泊芬凈(Caspofungin)、米卡芬凈 (Micafungin) 和阿尼芬凈 (Anidulafungin)，其中前兩者已在國內上市，阿尼芬凈已在國內臨床中[4-6]。

阿尼芬凈是由前體化合物棘白菌素B (Echinocandin B，ECB) 經猶他游動放線菌產生的酰化酶作用脫去側鏈亞油?；缓笤贒MF中與活性中間體4"-戊氧基-[1,1',4',1"]三苯基-4-甲酸-2,4,5-三氯-苯基酯反應制得，其化學結構如圖1A所示[7]。目前，ECB的化學結構已經確定，它的六肽支架是由6個氨基酸組成，包括：4R,5R-二羥基-L-鳥氨酸、L-蘇氨酸、4R-羥基-L-脯氨酸、3S,4S-二羥基-L-高酪氨酸、L-蘇氨酸和3S-羥基-4S-甲基-L-脯氨酸 (圖1B)[8]。

ECB是合成阿尼芬凈的關鍵前體化合物，其發(fā)酵單位的高低將直接影響阿尼芬凈的市場前景。根據文獻和專利報道，目前國內外ECB均是利用微生物發(fā)酵法進行制備，其中主要是以構巢曲霉進行發(fā)酵[9-12]。但是在該類微生物發(fā)酵過程中會碰到一些難以克服的技術問題，如發(fā)酵液粘度高、供氧不足以及傳質受阻等，這些問題都會導致菌種代謝合成產物的能力下降，因此ECB的發(fā)酵仍然處于實驗室研究階段。要解決上述問題，常用的方法有菌種誘變、培養(yǎng)基優(yōu)化、氣升式發(fā)酵罐培養(yǎng)、細胞固定化以及工藝操作條件調控 等[13-15]。近年來，研究學者提出了通過添加無機微粒來改變絲狀微生物菌體形態(tài)的新技術，發(fā)現無機微粒的應用可以顯著影響絲狀微生物生長過程中的菌體形態(tài)，并進一步影響產物產量及酶的活性，目前應用比較廣泛的無機微粒包括硅酸鹽、鈦酸鹽、滑石粉、Al2O3等[16-20]。

圖1 阿尼芬凈(A) 和ECB (B) 的化學結構式[7-8]

本文以構巢曲霉發(fā)酵合成ECB，希望通過添加不同種類及不同濃度的微粒來改善菌體生長形態(tài)，調控培養(yǎng)過程中的傳質過程，最終提高ECB的發(fā)酵產量。

1 材料與方法

1.1 菌種

構巢曲霉ZJB09223，由本實驗室保藏。

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基。

種子培養(yǎng)基 (g/L)：葡萄糖10，甘油10，棉籽粉25，pH 6.8?7.0，121 ℃滅菌20 min。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基 (g/L)：花生油20，甘油10，蛋白胨10，L-脯氨酸1，甘露醇90，豆粕粉40，K2HPO4?3H2O 8，MgSO4?7H2O 0.5，MnSO4?H2O 0.1，FeSO4?7H2O 0.05，CaCl20.3，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

1.3 主要儀器與設備

恒溫調速搖床 (上海杜科自動化設備有限公司 DKY-1)；高效液相色譜 (日本SHIMADZU)；高壓蒸汽滅菌鍋 (日本SANYO，MLS-3780)；電子分析天平 (上海精密儀器儀表有限公司FA2004)；高速冷凍離心機 (美國Bechman Coulter，X-22)；光學顯微鏡 (美國leica，DM3000)。

1.4 培養(yǎng)方法

1.4.1 斜面培養(yǎng)

將傳好種的斜面置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8?16 d，菌落表面呈現墨綠色后取出置于15?20 ℃繼續(xù)培養(yǎng)，一般5?20 d都可接種用于種子培養(yǎng)。

1.4.2 種子液培養(yǎng)

接種后的種子培養(yǎng)基在220 r/min、25 ℃條件下培養(yǎng)2 d。

1.4.3 發(fā)酵培養(yǎng)

按照10%接種量進行接種，然后將接種后發(fā)酵培養(yǎng)基在220 r/min、25 ℃條件下培養(yǎng)12 d，第6天起定時取樣測定ECB產量。每個條件做3個平行樣，最終結果取平均值。

1.5 分析方法

生物量 (g/L) 的測定：采用稱重法，取1 mL發(fā)酵液12 000 r/min離心10 min，棄上清，放入90 ℃烘箱烘干至恒重，計算得到生物量。

待測樣品預處理：取1 mL發(fā)酵液 12 000 r/mim離心8 min，棄上清；所得菌體加入1 mL甲醇，25 ℃振蕩萃取30 min， 12 000 r/min離心8 min，留上清液備用；殘留菌體中再加入1 mL甲醇進行二次萃取，25 ℃振蕩搖勻30 min，12 000 r/min離心8 min，所得上清液與前一步上清液合并，12 000 r/min離心2min，上清液用0.45μm水膜過濾，進行檢測。

產物的測定：產物ECB采用高效液相色譜(HPLC) 進行檢測，色譜柱為ODS-C18柱 (大連伊力特4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為乙腈：甲醇：水 = 2：7：1，流速為1.0 mL/min，紫外檢測波長為222 nm，進樣量20 μL，柱溫40 ℃。

2 結果與分析

2.1 微粒種類對ECB發(fā)酵過程的影響

本實驗選用了文獻報道較多的滑石粉、Al2O3以及玻璃珠作為無機微粒，考察了其對ECB發(fā)酵過程的影響。在發(fā)酵過程中，由于培養(yǎng)基中含有可作為微粒的豆粕粉 (d50= 8.8 μm)，為了消除其對結果的影響，本實驗首先比較了采用蒸煮過濾后的豆粕粉濾液作為有機氮源與未過濾的豆粕粉培養(yǎng)基進行發(fā)酵的結果 (圖2)，發(fā)現采用蒸煮過后的豆粕粉濾液作為氮源發(fā)酵時，其產量由原來的1 025.6 mg/L降為935.9 mg/L，下降了近10%，而下降的原因可能是由于氮源的損失造成的，也可能是由于作為微粒的豆粕粉顆粒被過濾除去造成的。

在后續(xù)實驗中，以蒸煮過濾后的豆粕粉培養(yǎng)基作為對照，考察了在其中加入不同微粒后對發(fā)酵過程的影響。發(fā)現對照組菌體在發(fā)酵過程中會自我纏繞，呈較大直徑的球狀生長，而添加滑石粉及玻璃珠后均可以改善發(fā)酵過程中微生物的菌絲形態(tài)，使ECB的發(fā)酵單位有所提高。當添加20 g/L 600目(d50= 5.7 μm) 滑石粉時，ECB產量由935.9 mg/L提高到1 054.4 mg/L；當加入3顆直徑為4 mm玻璃珠后，ECB產量提高到967.6 mg/L。而加入Al2O3后對ECB的產量反而有所抑制，推測可能是由于Al2O3粒徑過小 (d50= 4.7 μm) 引起的。

2.2 滑石粉粒徑及濃度對ECB發(fā)酵單位的影響

在上述實驗的基礎上，進一步考察了滑石粉的粒徑及其添加濃度對ECB發(fā)酵單位的影響。圖3為添加10 g/L不同粒徑滑石粉的結果，表明當滑石粉粒徑小于600目 (d50> 5.7 μm) 時，添加微?？梢蕴岣逧CB產量，而當其粒徑大于800目 (d50< 4.6 μm) 時，ECB產量反而會下降，并且微粒的添加對菌體濃度影響較小。而當添加粒徑大于800目的滑石粉時，雖然菌體濃度基本未受影響，但由于添加的粒徑較小，使得發(fā)酵過程中菌絲體包裹微粒后會在發(fā)酵液中形成致密的菌絲小球并充滿整個搖瓶，導致發(fā)酵液黏度增大，營養(yǎng)物質和氧氣的傳遞效果下降，從而使產物ECB發(fā)酵產量降低，這與上述實驗中添加Al2O3的結果是一致的。

圖2 微粒種類對棘白菌素B發(fā)酵產量的影響

圖3 滑石粉粒徑對ECB發(fā)酵產量的影響.

表1為不同濃度的滑石粉 (325目，d50= 14.2 μm) 對ECB發(fā)酵過程的影響，發(fā)現ECB的產量隨滑石粉添加濃度的增加呈現先升高后降低的趨勢，添加20 g/L滑石粉可以使ECB的產量提高33.2%至1 262.9 mg/L；而添加30 g/L 600目滑石粉 (d50= 5.7 μm) 時可以使ECB產量達到最高值1 144.7 mg/L (結果未列出)。由結果可知，在添加粒徑較小的微粒時，其添加濃度應適度增加，才能達到最佳的優(yōu)化效果，而這與文獻中的報道是相反的，推測可能是由于發(fā)酵菌種的不同引起的[20]。

同時在培養(yǎng)過程中發(fā)現，當添加滑石粉時可以顯著改善發(fā)酵過程中菌絲體的狀態(tài)，使菌體形成以微粒為核心的菌絲團，且培養(yǎng)基中菌絲球的直徑與對照相比明顯減小 (圖4)，從而提高了發(fā)酵液的傳質效果和溶氧量，使ECB產量明顯增加。而當添加的滑石粉濃度過高時，發(fā)酵液內微粒與菌絲球之間相互碰撞、摩擦的幾率大大提高，因此可能會切斷菌絲體，使菌體以分散狀菌絲的形態(tài)生長，增加了發(fā)酵液粘度，最終導致ECB發(fā)酵產量降低 (圖4，40 g/L)。

表1 滑石粉濃度對ECB發(fā)酵產量的影響

圖4 滑石粉濃度對微生物菌絲體形態(tài)的影響

2.3 玻璃珠的數目對ECB發(fā)酵單位的影響

表2為添加不同數量的玻璃珠對ECB發(fā)酵產量的影響，由結果可以看出添加玻璃珠也可以促使ECB發(fā)酵單位提高。當玻璃珠直徑為 4 mm、添加個數為5顆和7顆時，發(fā)酵液中ECB含量分別為1 117.4 mg/L和1 160.9 mg/L，分別比對照組分別提高了17.7%和22.4%。當玻璃珠直徑為6 mm、添加個數為5顆和7顆時，ECB產量會大幅提高，最高產量達到1 344.1 mg/L，比對照提高了41.7%。

觀察發(fā)酵液狀態(tài)可以看出，當培養(yǎng)基中添加適當濃度的玻璃珠時，玻璃珠產生的剪切力會切斷菌絲，使菌絲球直徑減小 (圖5B、5C)，氧氣分子和營養(yǎng)物質傳遞效果增強，ECB發(fā)酵產量提高，而當過量添加玻璃珠時 (9顆)，玻璃珠與菌絲體之間的碰撞和摩擦作用占主導地位，過高的剪切力會使培養(yǎng)基發(fā)生剪切稀化現象，從而導致了菌絲體的斷裂，培養(yǎng)基粘度降低，ECB產量下降 (圖5D)。

表2 玻璃珠的添加對ECB發(fā)酵產量的影響

圖5 玻璃珠(d = 4 mm)數量對微生物菌絲體形態(tài)的影響

3 討論

目前，ECB主要通過曲霉菌屬發(fā)酵法制備，但由于絲狀微生物發(fā)酵過程中會以菌絲球或分散狀菌絲的形態(tài)生長，從而導致發(fā)酵液粘度增加，溶氧量急劇下降，發(fā)酵水平降低。而通過添加無機微粒來改善菌體生長形態(tài)，調控培養(yǎng)過程中的傳質過程是近幾年來發(fā)展的新技術，該技術的應用可以優(yōu)化絲狀微生物的發(fā)酵過程，進而提高關鍵酶活性及發(fā)酵產物的產量。

本文初步考察了滑石粉、Al2O3以及玻璃珠對構巢曲霉發(fā)酵過程中ECB產量的影響，研究表明在搖瓶發(fā)酵生產ECB的培養(yǎng)基中，微粒的添加可以改善發(fā)酵過程中菌絲的生長形態(tài)，提高氧氣和營養(yǎng)物質的傳遞效率，增加ECB的發(fā)酵產量。微粒的濃度和粒徑是影響該過程的主要因素，隨著微粒濃度的提高，其對菌絲體產生的剪切力也不斷提高，使菌絲球直徑減小，氧氣和營養(yǎng)物質的傳遞效果得以改善；而當剪切力過高時，會使菌絲體大量斷裂，微生物的生長形態(tài)由菌絲球狀變?yōu)榉稚罹z，同時ECB產量降低。研究表明微粒的粒徑對ECB的發(fā)酵產量也有較大影響，添加適當粒徑的微?？梢允咕w包裹微粒形成粒徑較小的菌絲球，提高傳質效果；而粒徑過小則無法產生此作用。因此，在實際發(fā)酵過程中應根據不同的發(fā)酵菌株選擇不同的微粒濃度及粒徑，以提高發(fā)酵效果。該技術的應用為絲狀微生物發(fā)酵過程的優(yōu)化提供了一定的思路與借鑒，為解決絲狀微生物發(fā)酵過程遇到的高粘度、低溶氧等問題提供了重要的方法，然而現今主要研究工作多集中于國外，國內對此研究尚無報道，后續(xù)還需要在新型微粒發(fā)掘、影響機制考察等方面開展進一步的研究工作。

[1] Vazquez JA. Anidulafungin: A new echinocandin with a novel profile. Clin Ther, 2005, 27(6): 657?673.

[2] Ghannoum M, D'Angelo M. Anidulafungin: a potent antifungal that targetsand. Infect Dis Clin Practice, 2005, 13(4): 165?178.

[3] Denning DW. Echinocandins: a new class of antifungal. J Antimicrob Chemother, 2002, 49(6): 889?891.

[4] Chen SCA, Slavin MA, Sorrell TC. Echinocandin antifungal drugs in fungal infections a comparison. Drugs, 2011, 71(1): 11?41.

[5] Perlin DS. Current perspectives on echinocandin class drugs. Future Microbiol, 2011, 6(4): 441?457.

[6] Chandrasekar PH, Sobel JD. Micafungin: a new echinocandin. Clin Infect Dis, 2006, 42(8): 1171?1178.

[7] Nyfeler R, Keller SW. Metabolites of microorganisms. 143: echinocandin B, a novel polypeptide antibiotic fromvar. echinulatus: isolation and structural components. Helv Chim Acta, 1974, 57(8): 2459?2477.

[8] Emri T, Majoros L, Tóth V, et al. Echinocandins: production and applications. Appl Microbiol Biotechnol, 2013, 97(8): 3267?3284.

[9] Cockshott A, Sullivan GR. Improving the fermentation medium for Echinocandin B production. Part I: sequential statistical experimental design. Process Biochem, 2001, 36(7): 647?660.

[10] Cockshott A, Hartman B. Improving the fermentation medium for Echinocandin B production part II: particle swarm optimization. Process Biochem, 2001, 36(7): 661?669.

[11] Toth V, Nagy CT, Pocsi I, et al. The echinocandin B producer fungusvar. roseus ATCC 58397 does not possess innate resistance against its lipopeptide antimycotic. Appl Microbiol Biotechnol, 2012, 95(1): 113?122.

[12] Toth V, Nagy CT, Miskei M, et al. Polyphasic characterization of "var. roseus" ATCC 58397. Folia Microbiol, 2011, 56(5): 381?388.

[13] Gibbs PA, Seviour RJ, Schmid F. Growth of filamentous fungi in submerged culture: problems and possible solutions. Crit Rev Biotechnol, 2000, 20(1): 17?48.

[14] Xia JY, Wang YH, Zhang SL, et al. Fluid dynamics investigation of variant impeller combinations by simulation and fermentation experiment. Biochem Eng J, 2009, 43(3): 252?260.

[15] Rainer K, Thomas W, Manely EE, et al. Characterization and control of fungal morphology for improved production performance in biotechnology. J Biotechnol, 2013, 163(2): 112?123.

[16] Kaup BA, Ehrich K, Pescheck M, et al. Microparticle-enhanced cultivation of filamentous microorganisms: increased chloroperoxidase formation byas an example. Biotechnol Bioeng, 2008, 99(3): 491?498.

[17] Driouch H, H?nsch R, Thomas W, et al. Improved enzyme production by bio-pellets of: targeted morphology engineering using titanate microparticles. Biotechnol Bioeng, 2012, 109(2): 462?471.

[18] Driouch H, Roth A, Dersch P, et al. Filamentous fungi in good shape: microparticles for tailor-made fungal morphology and enhanced enzyme production. Bioeng Bugs, 2011, 2(2): 100?104.

[19] Walisko R, Krull R, Schrader J, et al. Microparticle based morphology engineering of filamentous microorganisms for industrial bio-production. Biotech Lett, 2012, 34(11): 1975?1982.

[20] Driouch H, Sommer B, Wittmann C. Morphology engineering offor improved enzyme production. Biotechnol Bioeng, 2009, 105(6): 1058?1068.

(本文責編 郝麗芳)

Effect of microparticles on echinocandin B production by

Kun Niu, Yibo Hu, Jian Mao, Shuping Zou, and Yuguo Zheng

,,310014,,

Anidulafungin is an effective antifungal medicine, which can inhibit activities of candidaand. Echinocandin B (ECB) is the key precursor of Anidulafungin, thus the price and market prospect of Anidulafungin is directly due to the fermentation titer of ECB. In this study,was used for ECB fermentation, and the influence of adding microparticles on ECB fermentation was studied, such as talcum powder, Al2O3, and glass beads. The particle size and concentration were the key factors for mycelium morphology and ECB production, and ECB production could reach 1 262.9 mg/L and 1 344.1 mg/L by adding talcum powder of 20 g/L (d50= 14.2 μm) and 7 glass beads (6 mm), an increase by 33.2% and 41.7%, respectively. The results indicated that the mycelium morphology of filamentous microorganisms and the product yield of fermentation could be improved by adding microparticles remarkably, and it provide an important method for the fermentative optimization of filamentous microorganisms.

Echinocandin B,, microparticles, fermentation

Novemeber 24, 2014;

January 4, 2015

National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2011CB710800).

Yuguo Zheng. Tel/Fax: +86-571-88320630; E-mail: zhengyg@zjut.edu.cn

國家重點基礎研究發(fā)展計劃 (973計劃) (No.2011CB710800) 資助。