趙雷明，劉衛(wèi)東，陳曦，王敏，馮進輝，吳洽慶，朱敦明

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嗜熱共生桿菌內消旋-2,6-二氨基庚二酸脫氫酶中Y76對輔酶偏好性影響

趙雷明1,2，劉衛(wèi)東2，陳曦2，王敏1，馮進輝2，吳洽慶2，朱敦明2

1天津科技大學生物工程學院 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津 300457 2中國科學院天津工業(yè)生物技術研究所 工業(yè)酶國家工程實驗室 天津市生物催化技術工程中心，天津 300308

趙雷明, 劉衛(wèi)東, 陳曦, 等. 嗜熱共生桿菌內消旋-2,6-二氨基庚二酸脫氫酶中Y76對輔酶偏好性影響. 生物工程學報, 2015, 31(7): 1108–1118.Zhao LM, Liu WD, Chen X, et al. Effect of residue Y76 on co-enzyme specificity of meso-diaminopimelate dehydrogenase from Symbiobacterium thermophilum. Chin J Biotech, 2015, 31(7): 1108–1118.

輔酶NAD(H) 相比NADP(H) 有穩(wěn)定性好、價格低廉及更廣的輔酶循環(huán)方法等優(yōu)勢，因此在實際應用中常需將NADP(H) 依賴型的脫氫酶改造成為NAD(H) 依賴型的。來源于嗜熱共生桿菌的NADP(H) 依賴型內消旋-2,6-二氨基庚二酸脫氫酶 (-2,6-diaminopimelate dehydrogenase,StDAPDH) 及其突變體酶是催化還原氨化合成D-氨基酸的優(yōu)良催化劑，本研究試圖改變其輔酶偏好性，增強其應用優(yōu)勢。對其晶體結構分析可知，氨基酸殘基Y76距離腺嘌呤較近，R35及R36和輔酶上磷酸基團有直接相互作用。依氨基酸側鏈基團性質對Y76進行了定點突變，發(fā)現(xiàn)不同突變子對兩種輔酶的偏好性都發(fā)生了變化；對與磷酸基團直接作用的R35、R36進行的雙突變R35S/R36V，導致酶對NADP+的催化活力降低；將R35S/R36V和部分Y76突變進行了組合，發(fā)現(xiàn)三突變組合以NAD+為輔酶時的活力均大于以NADP+為輔酶的活力，實現(xiàn)了輔酶偏好性轉變。這些研究工作為進一步實現(xiàn)StDAPDH的輔酶偏好性完全轉變提供依據。

氨基酸脫氫酶，內消旋-2,6-二氨基庚二酸脫氫酶，輔酶偏好性，突變

氨基酸脫氫酶是以氨基酸分子中-CH-NH2為氫供體，以NAD(P)+為受體的一類氧化還原酶，有嚴格的手性選擇性。野生型的氨基酸脫氫酶多為L-選擇性[1]，利用酶催化可逆反應的特點，這類酶被成功用于光學純L-氨基酸的生物合成；目前已知的D-氨基酸脫氫酶多為膜蛋 白[2-8]，僅有內消旋-2,6-二氨基庚二酸脫氫酶 (-2,6-D-diaminopimelate dehydrogenase) (DAPDH) (EC 1.4.1.16) 家族及它們的突變體酶可用來進行D-氨基酸的生物合成[9-12]。內消 旋-2,6-二氨基庚二酸脫氫酶 (DAPDH) 存在于賴氨酸合成途徑中，是一類NADP+-依賴型的氧化還原酶，它催化可逆的內消旋-二氨基庚二酸(-diaminopimelate，-DAP) 的D-手性碳上的氨基氧化脫氨，生成L-2-氨基-6-酮基庚二酸，反應方程式如圖1所示[13]。我們從嗜熱共生桿菌中獲得一個內消旋-2,6-二氨基庚二酸脫氫酶 (StDAPDH)[14],該酶可被直接用來還原氨化合成光學純D-丙氨酸，我們對其進行改造擴展了底物譜范圍[15]，而且還獲得了它的X-射線晶體結構[16]，為對StDAPDH開展深入研究奠定了基礎。

已報道的DAPDH家族野生型以及突變子酶均偏好于NADP(H)[9-12]，到目前為止尚無該家族酶輔酶偏好性改造的報道。輔酶NAD(H)和NADP(H) 相比而言，NAD(H) 有穩(wěn)定性好、價格低廉及更廣的輔酶循環(huán)再生方法等優(yōu) 勢[17]，在實際生產應用上，多傾向于使用NAD(H) 依賴型的脫氫酶。對DAPDH進行輔酶專一性改造，可以為DAPDH潛在的工業(yè)化應用提供支撐。

圖1 內消旋-二氨基庚二酸脫氫酶催化的反應[13]

輔酶NAD(H) 和NADP(H) 的主要區(qū)別在于2′位上的腺嘌呤上，NADP(H) 中該位置比NAD(H) 多連接了一個磷酸基團，而且該位置和輔酶在催化反應中提供質子的C4的位置較遠。在輔酶偏好性改造中，常?？梢酝ㄟ^改造和輔酶磷酸基團結合的氨基酸殘基如精氨酸 (R) 及賴氨酸 (K) 等來達到目的[18-30](表1)。

除了和磷酸基團相關的基團外，Crobu等[31]以及Baroni等[32]在改造鐵氧化還原蛋白NADP+還原酶時發(fā)現(xiàn)，臨近輔酶腺嘌呤的氨基酸殘基 (H286及Y258) 對輔酶偏好性也有影響，而且他們獲得的僅僅Y258位單突變就能使輔酶偏好性完全翻轉過來。

通過結構分析比較發(fā)現(xiàn)，StDAPDH結構中和輔酶腺嘌呤接近并可能影響輔酶偏好性的氨基酸為Y76，與輔酶NADP+上磷酸基團有直接作用的基團為R35和R36。對于StDAPDH中Y76對輔酶偏好性是否有影響進行了突變摸索，此外，還對和與輔酶NADP+上磷酸基團有直接作用的R35/R36位也進行了突變嘗試，并和Y76的部分突變子進行了組合突變測試。本文報道相關的研究結果。

表1 NAD(P)(H) 輔酶改造研究的總結

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒

實驗中所用感受態(tài)細胞大腸桿菌Top10以及BL21 (DE3) 均購自北京全式金生物技術有限公司；突變起始質粒pET32a-為本實驗室保存。

1.1.2 試劑

實驗中所用KOD DNA聚合酶、PCR相關KOD plus緩沖液、MgSO4、dNTPs購自日本TOYOBO公司；Fast-Digest限制性內切酶購自Fermentas公司；輔酶NADP(H) 以及NAD(H) 均購自Codexis公司；文中所用底物以及其他試劑均購自Alfa Aesar公司。質粒提取試劑盒、核酸回收試劑盒均購自北京全式金生物技術有限公司。實驗中所構建質粒均由金唯智生物科技有限公司進行序列測定。

1.1.3 培養(yǎng)基

文中所用培養(yǎng)基均為LB培養(yǎng)基，其中固體培養(yǎng)基中含1%瓊脂粉。

1.1.4 主要儀器

酶標儀為MD公司Spectramax M2；蛋白純化儀為?KTA purifier 10；所用層析柱以及填料均購自GE公司；APV2000高壓勻漿破碎儀購自APV公司；RC6+高速冷凍離心機購自Thermo公司；離心機為Eppendorf公司5430R；MJ Mini PCR儀；核酸、蛋白電泳系統(tǒng)以及Gel DocTMXR+凝膠成像系統(tǒng)均購自Bio-RAD公司；SS-325高壓滅菌鍋購自日本Tomy Kogyo公司。

1.2 方法

1.2.1 定點突變

根據[14]基因序列和擬突變的位點設計相應突變引物 (表2)，所有突變都以含突變前基因的質粒為模板，按照QuickChangeTM試劑盒操作說明進行相應突變。PCR過程：95 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，68 ℃延伸7 min，其中第二步至第四步循環(huán)20次，之后于68 ℃延伸20 min。PCR產物進行電泳確證。對擴增出來的目的片段進行切膠回收后，使用Ⅰ于30 ℃消化2 h，將消化產物轉化至大腸桿菌Top10感受態(tài)細胞中，涂布至含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上進行過夜培養(yǎng)，挑取單菌落接種至3 mL液體LB培養(yǎng)基中，菌體長出后離心取菌體提取質粒，并將質粒測序驗證，將序列正確的質粒轉化至大腸桿菌BL21 (DE3) 感受態(tài)中，進行后續(xù)表達純化工作。

表2 突變引物的序列

1.2.2 突變酶的表達純化

突變酶的表達、純化方法和野生型酶類 似[14]，首先將含過夜培養(yǎng)的種子液以1%的比例接種至2 000 mL含100 μg/mL氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中，于37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至600約1.0后，加入誘導劑異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷 (IPTG) 至終濃度為0.5 mmol/L，25 ℃、200 r/min繼續(xù)誘導12 h，4 ℃、5 000 r/min離心30 min收集菌體，菌體用緩沖液A (20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，500 mmol/L NaCl，5%甘油) 重懸，高壓勻漿破碎，破碎液于4 ℃、14 000 r/min離心30 min，收集上清液作為粗酶液，經過 0.22 μm濾膜過濾后進行鎳柱親和層析。鎳柱按照說明書進行再生處理并用緩沖液A進行平衡，上樣后先用緩沖液A將280紫外吸收洗至基線，再用15%比例的緩沖液B (20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，500 mmol/L NaCl，5%甘油，500 mmol/L咪唑) 洗脫雜蛋白，接著使用50%比例的緩沖液B洗脫目的蛋白,收集合并洗脫峰，使用Amicon Ultra-15 超濾管 (截留分子量：10 kDa) 進行超濾濃縮，置換緩沖液至緩沖液C (20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，50 mmol/L NaCl) 并進一步濃縮，濃縮后的酶用于SDS-PAGE以及酶學性質檢測。蛋白質濃度使用BCA試劑盒檢測，使用牛血清白蛋白BSA作為標準蛋白。

1.2.3 活力測定和動力學參數測定

酶活測定方法參見文獻[14]，以StDAPDH的天然底物內消旋-二氨基庚二酸 (-DAP) 為底物，以NAD(P)+為輔酶，通過檢測340下輔酶NAD(P)H生成時吸光值的變化來表征突變體的活性，輔酶的摩爾吸光系數為 6.22 mmol/(L·cm)。酶活測定體系為:10 mmol/L-DAP，0.5 mmol/L NAD(P)+，200 mmol/L Na2CO3/NaHCO3，pH 10.0，總體積為200 μL。酶活單位 (U) 定義為30 ℃下每分鐘生成 1 μmol NAD(P)H所需要的酶量。

對輔酶動力學參數的測定，具體條件如下：100 mmol/L Na2CO3-NaHCO3緩沖液 (pH 10)，10 mmol/L-DAP，NADP+終濃度在0.031?16 mmol/L 之間變動，NAD+終濃度在0.031?32 mmol/L之間變動。每個NADP+濃度做3?4次平行反應取平均值，利用GraphPad Prism軟件，根據Michaelis-Menten方程式計算野生型酶和各突變體酶對NADP+以及NAD+的表觀m和max值。

2 結果與分析

2.1 突變位點的選擇及突變設計

從StDAPDH結合輔酶的結構[16]可知，和磷酸基團有直接作用的殘基為R35和R36，Y76的位置類似于鐵氧化還原蛋白NADP+還原酶中靠近Y258的位置[31-32]，StDAPDH結構中這3個位置的氨基酸殘基和輔酶的位置關系見圖2。與NADP+的腺嘌呤環(huán)相臨近的76位酪氨酸，其空間位阻較大，且有極性的羥基；為了探索其對輔酶專一性是否有影響，以及是空間位阻還是極性對輔酶專一性產生影響，進行了突變改造，將其突變?yōu)楹推溆蓄愃拼笪蛔璧纳彼?(W)、苯丙氨酸 (F) 和略小位阻的疏水性氨基酸纈氨酸 (V)、甲硫氨酸 (M) 以及異亮氨酸 (I) 以探索空間位阻的影響，突變?yōu)橛H水氨基酸如堿性的精氨酸 (R)、酸性的谷氨酸 (E) 及組氨酸 (H) 以探索極性的影響。Lerchner等改造醇脫氫酶RasADH的輔酶偏好性從NADP+至NAD+的工作中[25]，起始酶與輔酶NADP+上磷酸基團相互作用的氨基酸殘基也是兩個精氨酸 (R38及R39)，通過將它們突變?yōu)镽38V/R39S后成功將輔酶偏好性改為NAD+依賴型。通過結構比較可以發(fā)現(xiàn)，StDAPDH中的R35及R36分別對應RasADH中的R39和R38。對StDAPDH設計了R35S/R36V雙突變，探索該雙突變是否和RasADH中一樣能使輔酶偏好性發(fā)生翻轉。突變引物序列見表2。

2.2 突變體的純化以及性質分析

我們首先對構建的Y76單突變進行了表達純化，利用純酶對兩種輔酶的活力進行了測定及比較，單突變的純酶結果見圖3，其與野生型對兩種輔酶的比活力比較見圖4。

圖2 StDAPDH中和輔酶偏好性可能相關的位點

通過對Y76位的不同單突變對兩種輔酶比活力的比較 (圖4)，我們可以看出，除Y76W外的所有突變子對NAD+的比活力均有所提高，而且所有Y76位突變子對NADP+的比活力均有所下降。在這些突變子中，位阻最大的Y76W對兩種輔酶的比活力為Y76位單突變中最低的，可能是因為其較大的位阻影響了NAD(P)+上腺嘌呤的結合，因而影響它們的活力。突變后位阻比酪氨酸略小的疏水氨基酸Y76F對輔酶活力變化趨勢和野生型酶影響趨勢最為接近，其對NAD+的比活力相比較野生型酶有所提高，其對NADP+的比活力是所有突變子中最高的；酸性氨基酸Y76E對NAD+的活力比Y76F有進一步提高，堿性氨基酸Y76H比Y76E對NAD+的活力更高，但對NADP+的活力略低；同為堿性的氨基酸Y76R比Y76H對NAD+的活力則更高一些，對NADP+的活力也相對更高；位阻更小的疏水性的Y76M、Y76V以及Y76I對NAD+的活力逐步增高，對NADP+的活力也相應逐步降低，表明它們的輔酶偏好性偏轉能力也逐步提高；在我們測試的這些Y76突變子中，Y76V及Y76I對NAD+的比活力最高。在所有Y76的突變子中，雖然Y76E有最高的NAD+/NADP+比值 (0.73)，但其對NAD+的活力并不是最高；而Y76I突變子，雖然NAD+/NADP+比值為0.69，但其對NAD+活力是Y76突變子中最高的。

為考察R35/R36為對輔酶偏好性的影響，我們借鑒別人的結果，進行了R35S/R36V雙突變；為考察Y76位的突變和R35、R36位突變是否有相互作用，我們選取了Y76單突變中對NADP+活力最高的Y76F，對NAD+活力最高的Y76V和Y76I，分別與R35S/R36V進行了組合突變，并進行了表達、純化及活力測定。純化結果見圖5。

圖3 StDAPDH Y76單突變純酶的SDS-PAGE結果

圖4 野生型和Y76單突變酶的比活力

R35S/R36V雙突變對StDAPDH輔酶偏好性影響和Y76W單突變類似，對兩個輔酶的活力都有明顯降低，而且對NAD+的比活力仍然低于對NADP+的比活力 (圖6)。對R35、R36兩個位點的突變結果表明，嘗試改造的R35S/R36V雖然確實對酶的偏好性有影響，其NAD+/NADP+比值 (1.25) 比所有Y76單突變 (最高值為0.73) 都高，但是對NAD+活力提高不明顯。R35S/R36V雙突變和Y76F組合后的R35S/R36V/Y76F對輔酶NAD+的比活力相比 Y76F單突變沒有明顯變化，但NAD+/NADP+比值卻從0.39提高到1.25，而且該突變對NAD+的比活力高于對NADP+的比活力；R35S/R36V和Y76I及Y76V組合后的突變子對NAD+的比活力也均高于它們對NADP+的比活力，而且它們的NAD+/NADP+比值也均有明顯提高，分別從0.69到1.39，以及0.53到1.36；在單突變中Y76I比Y76V對NAD+的比活力稍高，但在組合的三突變中，R35S/R36V/Y76V卻比R35S/R36V/Y76I對NAD+的比活力更高。這些結果表明，R35/R36位和Y76位組合后，可以獲得比單獨進行單突變或雙突變更好的結果，但其所起的作用并不是簡單的疊加。后續(xù)若想獲得更好結果，可能需要先篩選出R35/R36位較好的結果，并將較好的雙突變結果和76位進行進一步組合突變并進行篩選。

圖5 R35S/R36V以及三突變純酶的SDS-PAGE 結果

圖6 野生型和突變體酶的比活力

本研究中涉及的突變子動力學參數測定結果見表3。從表中可以看出，所有Y76突變對NAD+的m都降低了，而且除了Y76E外所有突變對NADP+的m也降低了，其中對NADP+的m值最小的是Y76F，這說明Y76F對NADP+的親和力最好；Y76E對NADP+的cat最高，但同時其m也最高，這說明Y76E在提高了其催化效率的同時也降低了對NADP+的親和力；對NAD+的m值最小的是空間位阻較小的Y76M、Y76I和Y76V，Y76V對NAD+的cat和cat/m是所有突變中最大的，這說明在對NAD+的親和力和催化效率中，空間位阻起到了重要的作用。

從表3中還可以看出，R35S/R36V對NADP+和NAD+的m、cat以及cat/m都降低了，這說明與磷酸基團有相互作用的R35、R36對輔酶親和力和催化效率有非常重要的作用。同時，還可以看出Y76對R35S/R36V的作用與Y76的單突變的效果一致，當Y76的空間位阻依次變小 (F、I、V) 時，其對NAD+的m也變??；通過比較單突變Y76V，Y76I和三突變R35S/R36V/Y76V和R35S/R36V/Y76I對NAD+的cat/m時可以發(fā)現(xiàn)，它們之間存在協(xié)同作用：Y76V的cat/m比Y76I大，但R35S/R36V/Y76V的cat/m卻比R35S/R36V/Y76I的數值小，這可能是因為Y76V和R35S/R36V都突變?yōu)槲蛔栎^小的氨基酸殘基，表3中m(NAD+)/m(NADP+) 值顯示，Y76突變對NAD+和NADP+親和力差異的貢獻各不相同，與野生型相比，空間位阻相對較小的M、V和I對輔酶的親和力更偏好于NAD+，其中Y76I的m(NAD+)/m(NADP+) 值比野生型的低了6倍多，顯示其對NAD+的親和力有明顯的提高。雙突變R35S/R36V與野生酶相比，m(NAD+)/m(NADP+) 值相差23倍，在此基礎上，增加額外的一個突變 (無論是Y76I，F(xiàn)或者V) 都導致此效果的進一步提升。表3中cat(NAD+)/cat(NADP+) 的結果顯示，與野生酶相比，大部分突變都導致了酶對NAD+和NADP+的cat差異的變化，其中以Y76R和Y76V導致酶選擇NAD+作為輔因子最有效，3個突變中，R35S/R36V/Y76I最高。

以上結果分析可知，R35、R36對NAD+和NADP+偏好性的選擇具有關鍵的作用，這可能是其直接與磷酸基團相互作用的結果。不僅如此，Y76對NAD+和NADP+的偏好性選擇也有重要的作用，可能通過對嘌呤環(huán)的作用，改變了NAD+在酶結構中的構象，使NAD+更好地與酶結合，導致催化效率的提高。

表3 野生型StDAPDH和所有突變子的動力學參數

3 討論

從上述結果中可以發(fā)現(xiàn)，雖然Y76單突變對NAD+的比活仍低于對NADP+的比活，但該位點的突變對輔酶偏好性確有影響，動力學數據結果表明，Y76位的突變是通過改變酶和輔酶NADP+和NAD+的親和力來影響其輔酶專一性的。對與NADP+磷酸基團有直接作用的R35/R36設計的R35S/R36V突變，雖然改變了輔酶偏好性，但對NAD+的比活力沒有明顯提升；而測試的Y76突變和R35S/R36V突變組合，對輔酶偏好性有影響的同時，對NAD+的比活力均已大于對NADP+的比活力。這些結果表明，距離腺嘌呤較近的Y76對StDAPDH的輔酶偏好性確有影響，而且該位置和與NADP+上磷酸有直接作用的R35及R36對輔酶偏好性有協(xié)同作用。

在本文進行的改造嘗試基礎上，對StDAPDH的R35、R36及Y76進行組合飽和突變，也許能獲得對NAD+活力更高的突變酶，相關研究工作正在進行中。

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(本文責編 陳宏宇)

Effect of residue Y76 on co-enzyme specificity of-diaminopimelate dehydrogenase from

Leiming Zhao1,2, Weidong Liu2, Xi Chen2, Min Wang1, Jinhui Feng2, Qiaqing Wu2, and Dunming Zhu2

1 Key Laboratory of Industrial Microbiology Fermentation of Ministry of Education, College of Biotechnology, Tianjin University of Science & Technology, Tianjin 300457, China 2 Tianjin Biocatalysis Technology Engineering Center, National Engineering Laboratory for Industrial Enzymes, Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308, China

Inindustrial application of NAD(P)H-dependent dehydrogenases, NAD(H) has the advantages over NADP(H) in higher stability, lower price and wider recycling system. Recently, ao-2,6-diaminopimelate dehydrogenase from(StDAPDH) has been found to be a useful biocatalyst for the production of D-amino acids, but it requires NADP(H) as co-enzyme. To switch the co-enzyme specificity from NADP(H) to NAD(H), we studied the effect of Y76 on the co-enzyme specificity of StDAPDH, because the crystal structural analysis indicated that residue Y76 is near the adenine ring. The mutation of Y76 exerted significant effect on the co-enzyme specificity. Furthermore, the double mutant R35S/R36V significantly lowered the specific activity toward NADP+, and the combination of R35S/R36V with some of the Y76 mutants resulted in mutant enzymes favorable NAD+over NADP+. This study should provide useful guidance for the further development of highly active NAD+-dependent StDAPDH by enzyme engineering.

amino acid dehydrogenase,-diaminopimelate dehydrogenase, co-enzyme preference, mutagenesis

October 30, 2014;

January 19, 2015

Key Deployment Project of Chinese Academy of Sciences (No. KSZD-EW-Z-016-3), National Natural Science Foundation of China (Nos. 21072151, 21102100), National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2011CB710801).

:Qiaqing Wu. Tel: +86-22-84861963; Fax: +86-22-84861996; E-mail: wu_qq@tib.cas.cn Dunming Zhu. Tel: +86-22-84861962; Fax: +86-22-84861996; E-mail: zhu_dm@tib.cas.cn

中國科學院重點部署項目 (No. KSZD-EW-Z-016-3)，國家自然科學基金 (Nos. 21072151, 21102100)，國家重點基礎研究發(fā)展計劃 (973計劃) (No. 2011CB710801) 資助。