馮凡，許楊，陶勇，劉偉豐，林白雪

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提高大腸桿菌通過MVA途徑合成異戊二烯

馮凡1,2，許楊1,2，陶勇3，劉偉豐3，林白雪3

1 南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047 2 南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院，江西 南昌 330047 3 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，北京 100101

馮凡, 許楊, 陶勇, 等. 提高大腸桿菌通過MVA途徑合成異戊二烯. 生物工程學(xué)報(bào), 2015, 31(7): 1073–1081.Feng F, Xu Y, Tao Y, et al. Improving isoprene production by engineered heterologous mevalonate pathway in Escherichia coli. Chin J Biotech, 2015, 31(7): 1073–1081.

異戊二烯是橡膠合成的重要前體物質(zhì)。為了提高菌株的異戊二烯產(chǎn)量，本實(shí)驗(yàn)室在研究中構(gòu)建了一株異戊二烯產(chǎn)氣的菌株BW-01，基于蛋白質(zhì)預(yù)算理論的指導(dǎo)，理性設(shè)計(jì)通過改變質(zhì)?？截悢?shù)、增加稀有密碼子等合成生物學(xué)手段調(diào)控關(guān)鍵限速酶編碼基因表達(dá)，從而提高大腸桿菌外源MVA代謝途徑的異戊二烯產(chǎn)量。搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中我們構(gòu)建的新產(chǎn)氣菌株BW-07比原有的產(chǎn)氣菌株BW-01的產(chǎn)量提高了73%，達(dá)到了 761.1 mg/L。為后續(xù)菌株改造及進(jìn)行發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

蛋白質(zhì)預(yù)算，MVA途徑，異戊二烯，大腸桿菌

異戊二烯(2-甲基-l,3-丁二烯) 是合成橡膠的重要前體物質(zhì)[1-3]，每年異戊二烯產(chǎn)量的95%被用于合成橡膠。此外，異戊二烯還是萜類化合物的結(jié)構(gòu)骨架[4-7]。目前，異戊二烯主要是通過高溫裂解石油氣、化學(xué)合成和異戊烯脫氫法等化工手段獲得，這樣的生產(chǎn)方式能耗高、污染大、工藝復(fù)雜且生產(chǎn)效率低，而且隨著石油等不可再生資源的枯竭，傳統(tǒng)的異戊二烯生產(chǎn)方式將逐漸被淘汰。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，以工程菌為對(duì)象，解決能源問題的可行性越來越大[8-10]。

自然界中，某些植物可以合成并釋放異戊二烯，而異戊二烯的合成前體物質(zhì)異戊烯焦磷酸(IPP) 和二甲基烯丙基焦磷酸酯(DMAPP) 已知的合成途徑有甲羥戊酸途徑 (Mevalonate pathway, MVA pathway) 和2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸途徑 (MEP pathway) 。隨著合成生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，目前已有研究者在大腸桿菌及酵母底盤中成功合成了多種萜類化合物或前體[11-14]。Keasling等[11-13]在大腸及酵母背景中通過代謝元件模塊化構(gòu)建及合成路徑的調(diào)控進(jìn)行青蒿二烯合成的研究已經(jīng)成為萜類生產(chǎn)研究的典范。

本實(shí)驗(yàn)室將MVA途徑分成3個(gè)代謝元件模塊 (圖1)，然后將其構(gòu)建到大腸桿菌中，使大腸桿菌生成異戊二烯，但細(xì)菌自身對(duì)于外源的MVA途徑缺乏調(diào)控能力。陶勇等提出了蛋白質(zhì)預(yù)算理論 (Protein budget)[15]，認(rèn)為單個(gè)細(xì)胞在特定生理?xiàng)l件下能表達(dá)的蛋白質(zhì)總量是相對(duì)恒定的，細(xì)胞內(nèi)不同蛋白質(zhì)之間的表達(dá)存在一定的比例。為了提高異戊二烯的產(chǎn)量，本研究基于合成生物學(xué)“元件-模塊-系統(tǒng)”的理念[15]，通過調(diào)控元件的表達(dá)能力來提高模塊的功能，進(jìn)而使整個(gè)系統(tǒng)達(dá)到最優(yōu)狀態(tài)。已有研究表明，在合成生物學(xué)中通過強(qiáng)啟動(dòng)子、采用高拷貝復(fù)制起始位點(diǎn)質(zhì)粒作為載體往往不能使各模塊的功能達(dá)到最優(yōu)狀態(tài)[9,16]。在整個(gè)系統(tǒng)里往往一個(gè)蛋白質(zhì)的過表達(dá)會(huì)破壞細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)間的相互平衡[17-18]，為了使我們搭建的系統(tǒng)能良好地運(yùn)作，在本研究中我們通過在上游元件內(nèi)增加稀有密碼子和基因拷貝數(shù)、改變下游元件拷貝數(shù)來改變單個(gè)元件的表達(dá)能力，從而使整個(gè)模塊的功能得到優(yōu)化，最終使整套系統(tǒng)的異戊二烯產(chǎn)量得到提高。

圖1 MVA途徑模塊示意圖

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒與菌種

克隆宿主菌DH5α和表達(dá)宿主菌BW25113 為本實(shí)驗(yàn)室保存；帶有MVA途徑酶編碼基因的質(zhì)粒 (表1)。前期的工作已經(jīng)構(gòu)建好了一株3質(zhì)粒體系的菌株，在BW25113宿主菌中含有pYESs、pSPMIc、pBAD-S 3個(gè)質(zhì)粒，成功地將外源MVA代謝途徑引入到大腸桿菌中并實(shí)現(xiàn)了表達(dá)。pYESs質(zhì)粒含有乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶/HMG-CoA合成酶 ()、甲羥戊酸合酶() 兩個(gè)酶的編碼基因；pSPMIc質(zhì)粒含有甲羥戊酸激酶 ()、磷酸甲羥戊酸激酶 ()、二磷酸甲羥戊酸脫羧酶 ()、異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶 () 4個(gè)酶的編碼基因；pBAD-S質(zhì)粒含有異戊二烯合成酶 () 。

1.1.2 試劑與儀器

GC 氣相色譜分析儀 (Agilent公司)；凝膠成像系統(tǒng) (美國(guó)BIO-RAD公司)；Mulotifuge X1R 高速冷凍離心機(jī) (美國(guó)Thermo公司)；SDS-PAGE 電泳儀 (美國(guó)BIO-RAD公司)；DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶 (Ⅰ、Ⅰ等) 購(gòu)自NEB公司；質(zhì)粒提取試劑盒、普通 PCR 產(chǎn)物回收試劑盒、膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基與溶液

LB液體培養(yǎng)基：1%蛋白胨，0.5%酵母提取物，1% NaCl。

固體培養(yǎng)基為上述成分再加入1.5%的瓊脂粉。

ZY培養(yǎng)基：1%蛋白胨，0.5%酵母提取物。

M9培養(yǎng)基(g/L)：Na2HPO46，KH2P043，NH4Cl l，NaCl 0.5，MgSO40.12。

1000×微量元素：50 mmol/L FeCl3， 20 mmol/L CaCl2，10 mmol/L MnCl2，10 mmol/L ZnSO4，CoCl2、NiCl2、Na2MO4、Na2SeO3、H3BO3各2 mmol/L。

50×5052: 25%甘油，2.5%葡萄糖，10%阿拉伯糖。

50×M溶液：1.25 mol/L Na2HPO4， 1.25 mol/L KH2PO4，2.5 mol/L NH4Cl， 0.25 mol/L Na2SO4。

1mol/L MgSO4：稱取24.6 g MgSO4?7H2O加ddH2O溶解，定容至100 mL，高壓滅菌。

自誘導(dǎo)培養(yǎng)基[19]ZYM-5052：在100 mL ZY 培養(yǎng)基中加入2 mL 50×M溶液，2 mL 50× 5052，1 mL 1mol/L MgSO4，100 μL 1000×微量元素。

1.2 方法

1.2.1 PCR獲得目的基因片段

以質(zhì)粒pBAD-S為模板, Is-F和Is-R為引物；pYESs為模板E1-F和Ms-R為引物；pSKPMIc為模板，MK-F和MK-R為引物 (表3)。PCR條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。加入Ⅰ酶消化模板，消化后產(chǎn)物回收。

1.2.2 目的基因構(gòu)建到相應(yīng)表達(dá)載體

PCR得到的產(chǎn)物和載體，用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶處理，按表1中描述，將相應(yīng)基因連接到不同拷貝數(shù)的載體 (表2) 再轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，在對(duì)應(yīng)的抗性平板上挑取陽(yáng)性克隆鑒定，并送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

表1 用于本研究的菌株和質(zhì)粒

表2 用于本研究的質(zhì)粒拷貝數(shù)

1.2.3 不同重組菌的構(gòu)建

按表4描述，將各部分表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到BW25113宿主菌中，在Carbr、CMr、Strpr三抗平板上挑取陽(yáng)性克隆。

1.2.4重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)

從新鮮的平板 (Carbr、CMr、Strpr三抗) 挑取單克隆，接種于5 mL含有對(duì)應(yīng)抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、250 r/min 振蕩培養(yǎng)12 h。然后按1%接種量轉(zhuǎn)接到50 mL自誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含Carbr、CMr、Strpr三抗)，37 ℃、250 r/min 誘導(dǎo)16 h，然后進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.2.5 重組菌的生物轉(zhuǎn)化及產(chǎn)物測(cè)定

經(jīng)過誘導(dǎo)的菌液4 ℃、4 000 r/min離心收集菌體。用M9培養(yǎng)基 (含4%葡萄糖) 重懸，使其600=60。取1 mL加入頂空瓶密封進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，然后行氣相色譜檢測(cè)，以異戊二烯標(biāo)準(zhǔn)品作為定量標(biāo)準(zhǔn)。系統(tǒng)采用Agilent Techbologies 7890A GC System型氣相色譜儀，色譜柱為HP-55% phenyl methyl siloxan色譜柱(30 m× 320 μm×0.25 μm)，檢測(cè)器為火焰離子化檢測(cè)器；氣化室溫度50 ℃，柱箱溫度240 ℃，檢測(cè)器溫度280 ℃。

表3 本研究中使用的引物

The bold sequences are the rare codons. Restriction sites are underlined.

2 結(jié)果與分析

2.1 MVA途徑上游編碼酶基因載體的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)構(gòu)建好BW-01產(chǎn)氣菌株為了降低基因的表達(dá)量，使整個(gè)系統(tǒng)更平衡，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的精氨酸密碼子AGA/AGG會(huì)降低外源蛋白質(zhì)的表達(dá)水平[20]，設(shè)計(jì)了引物 (表3) PCR得到帶有2個(gè)AGG稀有密碼子的基因片段 (約2 400 bp)；基因片段 (約1 100 bp)，圖2為PCR產(chǎn)物鑒定。測(cè)序結(jié)果也表明，片段的序列與實(shí)驗(yàn)室保存的序列一致。

增加了稀有密碼子的片段用Ⅰ和Ⅰ雙酶切后分別連接到載體pYBIS。如圖3A所示，重組質(zhì)粒再用Ⅰ和Ⅰ雙酶切后產(chǎn)生3 400 bp大小的載體和 2 400 bp的目的條帶，表明表達(dá)載體構(gòu)建成功，命名為pYE1Ss。將基因片段和質(zhì)粒pYESs用Ⅰ和Ⅰ雙酶切后連接。如圖3B所示，重組質(zhì)粒再用Ⅰ和Ⅰ雙酶切后，產(chǎn)生 6 500 bp大小的載體和約1 100 bp的目的條帶，表明表達(dá)載體構(gòu)建成功，命名為pYESKs。

2.2 MVA途徑下游Isps編碼酶基因載體的的優(yōu)化

用模板pBAD-S質(zhì)粒和引物 (表3) PCR獲得我們需要的基因片段 (約1 700 bp，圖2)；將基因片段用Ⅰ和Ⅰ雙酶切后，分別連接到不同復(fù)制起始位點(diǎn)的載體pABIA、pUBIA、pDBIA、pRBIA。如圖3C所示，重組質(zhì)粒再用Ⅰ和Ⅰ雙酶切后，產(chǎn)生3 300 bp大小的載體和1 700 bp的目的條帶，表明表達(dá)載體構(gòu)建成功，分別命名為pASa、pUSa、pDSa、pRSa。

圖2 MvaE-Mvas、MVK、Isps 3個(gè)基因片段PCR產(chǎn)物鑒定

2.3 重組產(chǎn)氣菌株的誘導(dǎo)表達(dá)

將優(yōu)化了上游表達(dá)載體的重組產(chǎn)氣菌株誘導(dǎo)表達(dá)16 h，SDS-PAGE分析結(jié)果顯示 (圖4A)，增加了稀有密碼子后BW-02菌中(93.2 kDa) 的表達(dá)量明顯比對(duì)照組的BW-01菌減少。在單個(gè)質(zhì)粒pYESs上又增加關(guān)鍵限速酶編碼基因(48.6 kDa) 的BW-03菌株在蛋白表達(dá)上和對(duì)照組的BW-01菌無明顯差異。

將優(yōu)化了酶編碼基因載體的重組產(chǎn)氣菌株誘導(dǎo)表達(dá)16 h，SDS-PAGE分析結(jié)果顯示 (圖4B)，改變酶編碼基因 (60 kDa) 載體的拷貝數(shù)，其蛋白表達(dá)未有明顯差異，但從圖上可以看到不同拷貝數(shù)的載體，對(duì)(93.2 kDa) 的蛋白表達(dá)產(chǎn)生微弱的影響。

圖3 重組質(zhì)粒pYE1Ss(A)、pYESKs(B)、pASa(C)、pUSa(C)、pDSa(C)、pRSa(C)的酶切驗(yàn)證

圖4 不同上游載體(A) 和不同下游載體菌(B) 誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE全菌圖

2.4 重組產(chǎn)氣菌的生物轉(zhuǎn)化及產(chǎn)物測(cè)定

采用搖瓶實(shí)驗(yàn)，自誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)重組產(chǎn)氣菌蛋白表達(dá)，16 h后收集菌體，用M9培養(yǎng)基 (含4%葡萄糖) 重懸，取1 mL加入頂空瓶密封進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，然后直接用氣相測(cè)譜檢測(cè)異戊二烯產(chǎn)量，以標(biāo)準(zhǔn)品異戊二烯為定量標(biāo)準(zhǔn)。優(yōu)化上游基因載體 (圖5)，增加稀有密碼子后，的表達(dá)量明顯下降，同時(shí)也使異戊二烯產(chǎn)量下降；上游載體上增加了限速酶基因，SDS-PAGE分析結(jié)果顯示，基因自身的表達(dá)量未有明顯提高，但異戊二烯的產(chǎn)量提高，BW-03菌株的產(chǎn)量達(dá)到517.3 mg/L。

改變Isps酶編碼基因載體 (圖6)，由于不同載體的復(fù)制起始位點(diǎn)不同，導(dǎo)致載體在菌體內(nèi)的拷貝數(shù)有區(qū)別，誘導(dǎo)表達(dá)后，酶的表達(dá)量未有明顯差異，但對(duì)(93.2 kDa) 的蛋白表達(dá)產(chǎn)生微弱的影響。通過檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，pRBIA質(zhì)粒作為酶編碼基因載體使異戊二烯產(chǎn)量明顯高于其他載體菌株，BW-07菌株的產(chǎn)量達(dá)到761.1 mg/L。

圖5 轉(zhuǎn)入不同上游表達(dá)載體后菌株的異戊二烯產(chǎn)量

圖6 轉(zhuǎn)入不同下游表達(dá)載體后菌株的異戊二烯產(chǎn)量

3 討論

本研究基于合成生物學(xué)的理念，采用合成生物學(xué)手段對(duì)原有的異戊二烯產(chǎn)氣菌株進(jìn)行改造，成功地提高了異戊二烯的產(chǎn)量，達(dá)到761.1 mg/L。

異戊二烯的生物合成其代謝途徑和調(diào)控機(jī)制復(fù)雜，將外源MVA代謝途徑的編碼酶基因整個(gè)構(gòu)建在大腸桿菌中并實(shí)現(xiàn)了異源表達(dá)，但由于所需的編碼酶基因多，只有一個(gè)載體的表達(dá)系統(tǒng)很難將整個(gè)代謝通路完全構(gòu)建成功，需要使用多個(gè)重組質(zhì)粒搭建一套完整的代謝途徑，這其中就涉及到多個(gè)表達(dá)模塊在細(xì)胞內(nèi)的調(diào)控。本實(shí)驗(yàn)開始構(gòu)建的菌株BW-01誘導(dǎo)表達(dá)后和基因編碼的蛋白質(zhì)都有明顯的過表達(dá)，基于蛋白質(zhì)預(yù)算理論認(rèn)為在合成生物學(xué)的研究中，模塊間不同的重組蛋白表達(dá)處于相對(duì)的平衡狀態(tài)時(shí)，才能使模塊的功能以及模塊間或模塊與宿主細(xì)胞間的適配性達(dá)到最佳狀態(tài)。針對(duì)本研究中的問題，我們采用增加稀有密碼子、改變載體拷貝數(shù)和增加關(guān)鍵限速酶編碼基因在載體上的拷貝數(shù)的方式來影響目的蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，增加稀有密碼子后基因表達(dá)量有明顯下降，但伴隨的是基因編碼蛋白質(zhì)的更多表達(dá)，這樣并沒有使整個(gè)系統(tǒng)內(nèi)蛋白質(zhì)的表達(dá)處于相對(duì)平衡狀態(tài)，異戊二烯的產(chǎn)量反而下降。增加了基因在載體上的拷貝，由于共用一個(gè)啟動(dòng)子，且在翻譯閱讀順序上靠后，因此在蛋白質(zhì)表達(dá)上未見明顯變化，但是異戊二烯的產(chǎn)量卻有了提高，推測(cè)是由于這一個(gè)表達(dá)基因的增加從而使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)又進(jìn)行了一次平衡，增加了整個(gè)系統(tǒng)的適配性。改變基因載體的拷貝數(shù)，我們選取的都是中低拷貝的載體，其在細(xì)胞內(nèi)的理論拷貝數(shù)存在差異但都較接近，結(jié)果顯示拷貝數(shù)的改變不只對(duì)基因編碼蛋白質(zhì)表達(dá)有一定的影響，也使基因的蛋白質(zhì)表達(dá)發(fā)生了改變，從而導(dǎo)致異戊二烯產(chǎn)量有了不同程度的提高。

蛋白質(zhì)的表達(dá)受到多種因素的影響，要實(shí)現(xiàn)定量精確調(diào)控還很困難，本研究中我們針對(duì)整個(gè)系統(tǒng)中某一個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)水平進(jìn)行微調(diào)控，最后卻改變了整個(gè)系統(tǒng)內(nèi)不同蛋白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)量。針對(duì)外源引入的這套代謝途徑在大腸桿菌中生產(chǎn)我們需要的目的產(chǎn)物，傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)重組表達(dá)系統(tǒng)理念，單純?cè)黾踊驕p少某個(gè)蛋白的表達(dá)來達(dá)到提高產(chǎn)量的思路是不可行的，我們并非追求獲得某個(gè)蛋白的高效表達(dá)，而是為了找到一個(gè)最優(yōu)的組合，使產(chǎn)物積累量得到提升。

本研究在蛋白質(zhì)預(yù)算理論的指導(dǎo)下，對(duì)實(shí)驗(yàn)室前期得到的工程菌做了優(yōu)化，找到了一個(gè)較好的模塊組合，使新得到的工程菌的異戊二烯產(chǎn)量較原有菌株提升了73%。這也印證了蛋白質(zhì)預(yù)算理論的正確性，為今后進(jìn)一步的研究提供了重要參考。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Improving isoprene production by engineered heterologous mevalonate pathway in

Fan Feng1,2, Yang Xu1,2, Yong Tao3, Weifeng Liu3, and Baixue Lin3

1 State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, Jiangxi, China 2 Jiangxi-OAI Joint Research Institute, Nanchang University, Nanchang 330047, Jiangxi, China 3 Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China

Isoprene is an important precursor of synthetic rubber material. In our previous study, metabolic engineeredstrain (BW-01) was constructed and used to produce isoprene. Based on the theory of protein budget, using synthetic biology strategies including the increased copy number ofgenes andrare codons, we regulated the expression of key enzyme to improve isoprene production instrain. Under shake-flask conditions, isoprene productivity of the engineered strain (BW-07) increased by 73% compared with BW-01, reached 761.1 mg/L. It provides a reference forfurther studies.

protein budget, mevalonate pathway, isoprene,

January 7, 2015;

March 3, 2015

Key Research Program of the Chinese Academy of Sciences (No. KGZD-EW-606-2), National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2012CB721105).

:Yang Xu. Tel: +86-791-8329479; E-mail: xuyang1951@163.com Yong Tao. Tel: +86-10-64807419; E-mail: taoyong@im.ac.cn

中國(guó)科學(xué)院重點(diǎn)部署項(xiàng)目 (No. KGZD-EW-606-2)，國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃) (No. 2012CB721105) 資助。