涂光偉，王永康，馮駿，李曉榮，郭美錦，鄒祥,4

?

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的出芽短梗霉遺傳轉(zhuǎn)化及高效篩選聚蘋果酸高產(chǎn)菌株

涂光偉1,2，王永康1,2，馮駿1,2，李曉榮1,2，郭美錦3，鄒祥1,2,4

1 西南大學(xué)藥學(xué)院，重慶 400715 2 重慶藥物過程與質(zhì)量控制工程技術(shù)中心，重慶 400715 3 華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237 4 重慶大學(xué)生物流變科學(xué)與技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400044

涂光偉, 王永康, 馮駿, 等. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的出芽短梗霉遺傳轉(zhuǎn)化及高效篩選聚蘋果酸高產(chǎn)菌株. 生物工程學(xué)報(bào), 2015, 31(7): 1063–1072.Tu GW, Wang YK, Feng J, et al. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Aureobasidium pullulans and high-efficient screening for polymalic acid producing strain. Chin J Biotech, 2015, 31(7): 1063–1072.

建立根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的出芽短梗霉遺傳轉(zhuǎn)化方法及T-DNA突變庫，高效篩選聚蘋果酸高產(chǎn)菌株及功能基因。通過含潮霉素和草銨磷抗性基因的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化出芽短梗霉，抗性壓力篩選及PCR驗(yàn)證建立根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的出芽短梗霉遺傳轉(zhuǎn)化方法，結(jié)合發(fā)酵液pH與聚蘋果酸含量響應(yīng)變化，微孔板高效篩選高產(chǎn)聚蘋果酸的T-DNA插入突變株，基因組步移確定T-DNA插入位點(diǎn)及功能基因。結(jié)果獲得遺傳穩(wěn)定的抗性基因菌株，每107個(gè)細(xì)胞可獲得80?120個(gè)轉(zhuǎn)化子，出芽短梗霉H27 號T-DNA突變株聚蘋果酸搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量提高24.5%，基因組步移證實(shí)糖酵解途徑磷酸甘油酸變位酶基因被破壞。成功建立了根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的出芽短梗霉遺傳轉(zhuǎn)化方法和T-DNA插入突變庫，結(jié)合高效篩選方法為聚蘋果酸合成功能基因挖掘及高產(chǎn)機(jī)制解析奠定基礎(chǔ)。

農(nóng)桿菌，出芽短梗霉，遺傳轉(zhuǎn)化，高效篩選，聚蘋果酸

出芽短梗霉是一種具有工業(yè)應(yīng)用價(jià)值的真菌，能發(fā)酵產(chǎn)生聚蘋果酸、葡萄糖酸、普魯蘭多糖、酶制劑等多種代謝產(chǎn)物，其中聚蘋果酸是一種新型聚酯型聚合物，具有良好的水溶性、生物安全性和易降解性，可用于新型藥物載體、組織工程、食品包裝材料等領(lǐng)域。本課題組前期分離得到一株聚蘋果酸高產(chǎn)菌株CCTCC M2012223，建立了聚蘋果酸酸水解制備蘋果酸新工藝技術(shù)[1]，并對聚蘋果酸發(fā)酵調(diào)控、聚合途徑解析等方面開展研究[2-3]。

出芽短梗霉俗稱“類酵母真菌”，由于遺傳不穩(wěn)定性，形成許多變種，其生活史中具有酵母樣和真菌菌絲體兩種形態(tài)，形態(tài)形成受到外界培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件等各種因素影響，導(dǎo)致其遺傳操作困難[4]。本課題組嘗試?yán)媒湍赋墒斓倪z傳轉(zhuǎn)化方法如電轉(zhuǎn)化[5]、PEG介導(dǎo)的LiAc轉(zhuǎn) 化[6]等，用于出芽短梗霉遺傳轉(zhuǎn)化，但未獲成功，原因可能在于出芽短梗霉通常分泌多糖到細(xì)胞壁外形成粘性保護(hù)層[7]；Cullen等[8]最早報(bào)道了出芽短梗霉原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法，但是該方法操作復(fù)雜，轉(zhuǎn)化效率不高；本課題組也曾嘗試該方法發(fā)現(xiàn)對原生質(zhì)體的質(zhì)量要求很高，轉(zhuǎn)化操作苛刻，對同源重組的敲除株轉(zhuǎn)化效率低。

根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化 (mediated transforation, ATMT) 作為一種高效的遺傳轉(zhuǎn)化方法，在真菌遺傳轉(zhuǎn)化中得到廣泛應(yīng)用[9]，與原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化相比，ATMT更高效、方便、省時(shí)。此外，大部分ATMT產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化子含有單個(gè)T-DNA (Transferred DNA) 拷貝[9-10]，通過ATMT方法將T-DNA隨機(jī)插入至真菌基因組，構(gòu)建突變體庫，已成為根據(jù)突變體的表型篩選相關(guān)功能基因的有效方法[11]。因此，為了深入探究聚蘋果酸生物合成調(diào)控基因，本文嘗試建立根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的出芽短梗霉遺傳轉(zhuǎn)化方法，并利用ATMT構(gòu)建出芽短梗霉隨機(jī)T-DNA突變庫，結(jié)合發(fā)酵液pH值與聚蘋果酸產(chǎn)量的響應(yīng)模型，微孔板高效篩選聚蘋果酸高產(chǎn)突變株，獲得一株T-DNA破壞磷酸甘油酸變位酶基因的突變株，聚蘋果酸發(fā)酵產(chǎn)量提高了24.5%。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

根癌農(nóng)桿菌AGL-1.pk2-包含帶潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶基因 (Hygromycin B phosphotransferase,) 的雙元載體pk2-，根癌農(nóng)桿菌AGL-1.pk2-包含的雙元載體由編碼草胺磷抗性基因草胺磷乙酰轉(zhuǎn)移酶 (Phosphinothricin acetyltranferase,) 替換pk2-上的而來，由西南大學(xué)生物技術(shù)中心張永軍研究員饋贈。質(zhì)粒圖譜見圖1。出芽短梗霉CCTCC M2012223由本實(shí)驗(yàn)室篩選保藏。

1.2 主要試劑和引物

潮霉素B (Genview)、乙酰丁香酮(Aldrich)、卡那霉素 (Japan)、羧芐青霉素 (Germany)、溴酚藍(lán) (Genview)、溶壁酶 (Sigma)、蛋白酶K (Sigma) 購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；草銨磷(除草劑Basta glufosinate-ammonium，phosphinothricin, ppt) 購自永農(nóng)生物科學(xué)有限公司；頭孢他啶 (注射液) 由深圳立鍵藥業(yè)生產(chǎn)；DNA Walking SpeedUPTM Premix Kit (Seegene)、DNA聚合酶等分子生物學(xué)常規(guī)試劑購自TaKaRa。常規(guī)理化試劑均為國產(chǎn)分析純。本研究所用引物見表1，由金斯瑞生物科技有限公司合成。

圖1 雙元載體pk2-hyg

1.3 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

將根癌農(nóng)桿菌AGL-1接種于YCK瓊脂平板 (g/L): 酵母提取物10，蛋白胨5，蔗糖5，MgSO4?7H2O 0.5，瓊脂20，卡那霉素50 mg/L，羧芐青霉素50 mg/L，28 ℃培養(yǎng)48 h，挑取單菌落接種于250 mL搖瓶培養(yǎng)24 h至660達(dá)到0.6?0.8。

表1 本研究所用引物

將出芽短梗霉CCTCC M2012223接種于PDA瓊脂平板中，25 ℃培養(yǎng)48 h挑取單菌落培養(yǎng)種子，出芽短梗霉種子培養(yǎng)基 (g/L)：葡萄糖60，NH4NO32，KH2PO40.1，MgSO4?7H2O 0.1，ZnSO40.1，KCl 0.5，CaCO320，種子培養(yǎng)48 h，按10% () 接種量接種發(fā)酵培養(yǎng)基 (g/L)：葡萄糖90，NH4NO32，KH2PO40.1，MgSO4?7H2O 0.1，ZnSO40.1，KCl 0.5，CaCO330，搖床220 r/min培養(yǎng)4 d。

1.4 出芽短梗霉篩選壓力敏感性試驗(yàn)

取出芽短梗霉培養(yǎng)液100 μL均勻涂布于含有不同濃度草銨磷或潮霉素B的M100瓊脂平板上，25 ℃培養(yǎng)7 d, 觀察并記錄生長情況。

1.5 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化出芽短梗霉

將根癌農(nóng)桿菌AGL-1培養(yǎng)660至0.7?0.8, 4 ℃離心收集菌體, 冰上用IM液體培養(yǎng)基 (g/L):葡萄糖1.8, K2HPO40.3, NaCl 0.3, MgSO4?7H2O 0.3，MES 7.8，200 μmol/L乙酰丁香酮，pH 5.3，清洗并重懸至660約0.2，培養(yǎng)8 h后待用。收集對數(shù)期出芽短梗霉細(xì)胞，用無菌水稀釋至109?1012個(gè)/L后，取100 μL細(xì)胞與培養(yǎng)待用的農(nóng)桿菌AGL-1混勻后，均勻涂布于表面鋪有水相微孔濾膜的IM瓊脂平板上，22 ℃共培養(yǎng)60 h，將微孔濾膜轉(zhuǎn)移至含有合適篩選壓力 (0.5 g/L頭孢他啶和30 mL/L草銨磷或100 mg/L潮霉素B) 的M100瓊脂平板上[10]，25 ℃培養(yǎng)3?6 d至出現(xiàn)轉(zhuǎn)化子，將濾膜上的轉(zhuǎn)化子挑至含有雙倍篩選壓力的M100液體培養(yǎng)基的96孔板中復(fù)篩。

1.6 轉(zhuǎn)化子基因組提取及PCR驗(yàn)證

以轉(zhuǎn)化子基因組為模板，出芽短梗霉原始菌CCTCC M2012223基因組為對照，pk2-和pk2-質(zhì)粒為陽性對照，Bar.F/Bar.R、Hyg.F/Hyg.R、Gus.F/Gus.R為引物檢測轉(zhuǎn)化子基因組中是否存在標(biāo)記基因序列。PCR條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性 30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；10 ℃保持。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠上電泳檢測。

1.7 T-DNA插入突變株發(fā)酵驗(yàn)證與聚蘋果酸產(chǎn)物分析

將T-DNA插入突變株在不含篩選壓力的PDA瓊脂平板上連續(xù)接傳5代，再接種于含有相應(yīng)篩選壓力的平板上觀察生長情況，考察突變株的遺傳穩(wěn)定性，并接種發(fā)酵培養(yǎng)基，以出芽短梗霉CCTCC M2012223為對照菌株，搖瓶驗(yàn)證突變株的產(chǎn)聚蘋果酸產(chǎn)量。聚蘋果酸產(chǎn)物分析采用高效液相色譜法，取發(fā)酵液上清液1 mL，加入1 mL 2 mol/L H2SO4， 90 ℃酸水解9 h，進(jìn)行HPLC分析[1]。

1.8 基因組DNA步移

以發(fā)酵驗(yàn)證的高產(chǎn)聚蘋果酸突變株H27基因組為模板，參考報(bào)道的方法擴(kuò)增T-DNA標(biāo)記基因側(cè)翼序列[12]。引物為標(biāo)記基因啟動子PtrpC靶序列特異結(jié)合的TSP1、TSP2、TSP3和DNA Walking SpeedUPTM Premix Kit試劑盒中的隨機(jī)引物DW-ACP，以突變株H27基因組為模板經(jīng)三輪巢式PCR擴(kuò)增側(cè)翼序列。PCR產(chǎn)物膠回收后，送華大基因測序，將所測序列與出芽短梗霉CCTCC M2012223基因組進(jìn)行比對，以確定T-DNA插入位點(diǎn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 出芽短梗霉篩選壓力敏感性試驗(yàn)

為了篩選出芽短梗霉菌株敏感的選擇壓力和確定其工作濃度，以真菌培養(yǎng)常用的抑制劑草銨磷和潮霉素B為例，考察了出芽短梗霉菌株在不同抑制劑濃度條件下的生長情況，結(jié)果如表2所示，草銨磷濃度為30 mL/L時(shí)，在培養(yǎng)4 d內(nèi)能有效抑制細(xì)胞生長，第7天出現(xiàn)極少量微小菌落；潮霉素濃度在100?300 mg/L時(shí)，可完全抑制菌株生長。因此確定草銨磷濃度 30 mL/L和潮霉素B濃度100 mg/L為抑制出芽短梗霉生長的最低抑制濃度。

2.2 轉(zhuǎn)化子篩選

以潮霉素B為篩選壓力，進(jìn)行根癌農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化。如圖2所示，M100瓊脂平板中培養(yǎng)約6 d后微孔濾膜上長出可見菌落，隨機(jī)挑選16株復(fù)篩得到的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證標(biāo)記基因是否插入出芽短梗霉基因組，其中14株檢出標(biāo)記基因，占87.5%。對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，結(jié)合幾次轉(zhuǎn)化效果表明，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的出芽短梗霉遺傳轉(zhuǎn)化效率為每107個(gè)細(xì)胞可獲得80?120個(gè)轉(zhuǎn)化子。

表2 不同濃度潮霉素B和草銨磷對出芽短梗霉的生長抑制情況

a: weedicide liquid Basta glufosinate-ammonium; b: 100% inhibited; +: inhibited; –: growth.

2.3 轉(zhuǎn)化子基因組PCR驗(yàn)證

各選取5株菌落PCR篩選出的抗草銨磷和抗潮霉素的轉(zhuǎn)化子提取基因組，分別對標(biāo)記基因、進(jìn)行擴(kuò)增，轉(zhuǎn)化子中均檢測出與陽性對照相同的條帶 (圖3A)，表明標(biāo)記基因已經(jīng)整合到基因組中。以篩選出的含有標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)化子為出發(fā)株，再次轉(zhuǎn)化標(biāo)記基因，獲得了同時(shí)整合多個(gè)標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)化子 (圖3B)，基于此可以實(shí)現(xiàn)對宿主的多次遺傳 改造。

2.4 T-DNA突變庫高效篩選

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化可以將T-DNA隨機(jī)整合到宿主基因組中，從而獲得一定數(shù)量的突變株，這些突變株在基因組水平上受到外源DNA的插入干擾可能會引起不同的性狀改變。突變株在不含有潮霉素和草銨磷的培養(yǎng)基上連續(xù)傳5代后依然能在含潮霉素和草銨磷的平板上生長，表明插入的T-DNA可以在出芽短梗霉基因組中穩(wěn)定遺傳。出芽短梗霉CCTCC M2012223是本課題組篩選獲得的聚蘋果酸高產(chǎn)菌株，由于聚蘋果酸分子結(jié)構(gòu)中帶弱酸基團(tuán) (-COOH)，導(dǎo)致發(fā)酵液呈酸性變化。通過向微孔板中加入pH指示劑溴甲酚綠培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)如圖4A所示，突變株發(fā)酵液顏色由綠色向黃色不同程度變化，表明發(fā)酵液中pH值能一定程度上反映菌株產(chǎn)酸能力的強(qiáng)弱。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，出芽短梗霉發(fā)酵產(chǎn)生酸性物質(zhì)主要是聚蘋果酸，其次有乳酸、乙酸、琥珀酸等雜酸，且總雜酸含量較低[13]，因此，可建立發(fā)酵液pH值與氫離子濃度的響應(yīng)模型：

y=–lg(2)

式中，為氫離子濃度；為pH；0為聚蘋果酸電離常數(shù)；0為聚蘋果酸濃度 (g/L)；1=10–3.86為乳酸電離常數(shù)；1為乳酸酸濃度(mol/L)；2=10–4.76為乙酸電離常數(shù)；2為乙酸酸濃度 (mol/L)；3=10–4.21為琥珀酸電離常數(shù)；3為琥珀酸酸濃度 (mol/L)；w=10–14為水電離常數(shù)；為常數(shù)。將聚蘋果酸發(fā)酵液上清按比例稀釋，測定的多組0以及對應(yīng)的值，代入公式 (1) 和(2)，通過遺傳算法迭代處理，非線性擬和得到發(fā)酵液中聚蘋果酸濃度與環(huán)境pH值的響應(yīng)模型 (圖4B)，表明隨著聚蘋果酸濃度增加，環(huán)境pH值呈下降趨勢，因此，基于響應(yīng)模型，可高效測定微孔板中培養(yǎng)物的pH值，作為聚蘋果酸高產(chǎn)突變株的初篩依據(jù)(圖4C)。

圖2 轉(zhuǎn)化子的抗性篩選及菌落PCR

圖3 轉(zhuǎn)化子的耐受篩選及標(biāo)記基因分析

圖4 微孔板出芽短梗霉發(fā)酵液pH值與聚蘋果酸濃度響應(yīng)變化

根據(jù)微孔板初篩結(jié)果, 隨機(jī)挑選14株含標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行搖瓶發(fā)酵驗(yàn)證，結(jié)果如圖5所示，與原始菌株相比，大多數(shù)T-DNA插入突變株聚蘋果酸產(chǎn)量下降，而H27號菌株聚蘋果酸發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)到 (29.60±0.88) g/L，比出發(fā)菌提高了24.5%。表明采用T-DNA插入方式，導(dǎo)致多數(shù)轉(zhuǎn)化子表現(xiàn)為負(fù)突變效應(yīng)。

2.5 T-DNA插入突變株H27基因組步移分析

對T-DNA插入突變株H27進(jìn)行基因組步移分析，如圖6所示，T-DNA側(cè)翼擴(kuò)增得到 657 bp片段，與本課題組完成的CCTCC M2012223基因組測序數(shù)據(jù)比對，發(fā)現(xiàn)g3187.t1基因 (磷酸甘油酸變位酶, EC 5.4.2.4) 讀碼框被破壞。

g3187.t1基因編碼區(qū)全長2 220 bp，編碼739個(gè)氨基酸，在1 794 bp處插入T-DNA。磷酸甘油酸變位酶在糖酵解反應(yīng)中，催化1,3-二磷酸甘油酸轉(zhuǎn)變?yōu)?,3-二磷酸甘油酸[14]。已有的研究表明，聚蘋果酸主要通過TCA循環(huán)來源的蘋果酸聚合而成[15]，突變株H27磷酸甘油酸變位酶基因破壞可能會促進(jìn)1,3-二磷酸甘油酸向3-磷酸甘油酸轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致糖酵解代謝通量增加，促進(jìn)聚蘋果酸合成。

圖5 T-DNA插入突變對聚蘋果酸發(fā)酵產(chǎn)量的影響

圖6 出芽短梗霉插入突變株T-DNA側(cè)翼序列及破壞基因

3 討論

本實(shí)驗(yàn)研究表明，通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)能夠?qū)⑼庠碊NA片段整合到出芽短梗霉基因組中穩(wěn)定遺傳，其轉(zhuǎn)化效率是已報(bào)道原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的50倍以上。Zhang等[9]報(bào)道了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的蠟蚧輪枝菌遺傳轉(zhuǎn)化方法，并觀察到了T-DNA插入突變株的不同表型變化。Tzima等[16]利用潮霉素為篩選標(biāo)記，以熒光蛋白為報(bào)告基因建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的根串珠霉遺傳轉(zhuǎn)化方法。Lin等[17]報(bào)道了以潮霉素、博來霉素、諾爾絲菌素為篩選標(biāo)記實(shí)現(xiàn)了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的圓紅冬孢酵母遺傳轉(zhuǎn)化，每105個(gè)細(xì)胞含400個(gè)轉(zhuǎn)化子。本實(shí)驗(yàn)以潮霉素和草銨磷為篩選壓力建立的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的出芽短梗霉遺傳轉(zhuǎn)化方法，每107個(gè)細(xì)胞含80?120個(gè)轉(zhuǎn)化子，具有較高的轉(zhuǎn)化效率，可實(shí)現(xiàn)對同一宿主的多次遺傳改造。

目前從出芽短梗霉基因組水平進(jìn)行遺傳操作研究較少[18]，主要原因在于出芽短梗霉代謝產(chǎn)物的生物合成網(wǎng)絡(luò)不清晰，傳統(tǒng)原生質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化效率低下。利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法構(gòu)建T-DNA插入突變文庫，為出芽短梗霉代謝產(chǎn)物的功能基因挖掘提供便利。如李中明等[11]構(gòu)建T-DNA插入突變庫，快速篩隱球酵母葡萄糖去阻遏基因；羅志兵等[19]利用環(huán)境脅迫來篩選對高溫和高滲等逆境脅迫敏感的球孢白僵菌T-DNA隨機(jī)插入突變體，并克隆相關(guān)基因。隨著出芽短梗霉菌株的全基因組測序完成[20]，本研究構(gòu)建的出芽短梗霉T-DNA突變庫及高效篩選方法，將為后續(xù)全基因組覆蓋的突變株篩選、聚蘋果酸合成的功能基因挖掘及調(diào)控機(jī)制解析提供基礎(chǔ)。

致謝：本論文所用實(shí)驗(yàn)材料由西南大學(xué)生物技術(shù)中心張永軍研究員饋贈，并參與實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)和論文修改，在此一并表示感謝！

[1] Zou X, Zhou Y, Yang ST. Production of polymalic acid and malic acid byfermentation and acid hydrolysis. Biotechnol Bioeng, 2013, 110(8): 2105?2113.

[2] Zou X, Tu G, Zan Z. Cofactor and CO2donor regulation involved in reductive routes for polymalic acid production byCCTCC M2012223. Bioproc Biosyst Eng, 2014, 37(10): 2131?2136.

[3] Wu XY, Zhou F, Tu GW, et al. Gene cloning, expression and characterization of malate-CoA ligase in the polymerization pathway of polymalic acid from. Acta Microbiol Sin, 2014, 54(8): 919?925 (in Chinese).吳小燕, 周峰, 涂光偉, 等. 聚蘋果酸聚合途徑中蘋果酰輔酶A連接酶基因的克隆、表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì). 微生物學(xué)報(bào), 2014, 54(8): 919?925.

[4] Chi Z, Wang F, Chi Z, et al. Bioproducts from, a biotechnologically important yeast. Appl Microbiol Biotechnol, 2009, 82(5): 793?804.

[5] Thompson JR, Register E, Curotto J ,et al. An improved protocol for the preparation of yeast cells for transformation by electroporation. Yeast, 1998, 14(6): 565?571.

[6] Gietz RD. Yeast Genetics: Methods in Molecular Biology. New York: Springer, 2014: 33?44.

[7] Simon L, Cayevaugien C, Bouchonneau M. Relation between pullulan production, morphological state and growth-conditions innew observations. J Gen Microbiol, 1993, 139(5): 979?985.

[8] Cullen D, Yang V, Jeffries T, et al. Genetic transformation of. J Biotechnol, 1991, 21(3): 283?288.

[9] Zhang YJ, Zhao JJ, Xie M, et al.mediated transfor mation in the entomopathogenic fungusand development of benzimidazole fungicide resistant strains. J Microbiol Meth, 2014, 105(10): 168?173.

[10] Gao XX, Yang Q.mediated transformation ofand its T-DNA insertional mutag enesis. Acta Microbiol Sin, 2005, 45(1): 129?131 (in Chinese).高興喜, 楊謙. 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的球毛殼菌遺傳轉(zhuǎn)化及T-DNA插入突變體的獲得. 微生物學(xué)報(bào), 2005, 45(1): 129?131.

[11] Li ZM, Pan J, Zhu XD.mediated transformation (ATMT) for the screening for genes involved in laccase glucose repression in the pathogenic yeast.Acta Microbiol Sin,2012, 52(1): 44?51 (in Chinese).李中明, 潘皎, 朱旭東. 利用根癌農(nóng)桿菌T-DNA插入突變尋找參與漆酶葡萄糖阻遏的關(guān)鍵基因. 微生物學(xué)報(bào), 2012, 52(1): 44?51.

[12] Liu YG, Chen Y. High-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR for amplification of unknown flanking sequences. Biotechniques, 2007, 43(5): 649?650.

[13] Zan ZQ, Zou X. Efficient production of polymalic acid from raw sweet potato hydrolysate with immobilized cells ofCCTCC M2012223 in aerobic fibrous bed bioreactor. J Chem Technol Biot, 2013, 88(10): 1822?1827.

[14] KEGG. [2015-06-29]. http://www.kegg.jp/kegg- bin/show_pathway?ec00010+5.4.2.4.

[15] Cheng RD, Wang H, Zhou H, et al. Investigation of poly (β-malic acid) synthesis pathways and regulation by strains of. J Chem Ind Eng, 2012, 63(11): 3639?3644 (in Chinese).程若東, 王浩, 周華, 等. 出芽短梗霉積累聚蘋果酸途徑及調(diào)控研究. 化工學(xué)報(bào), 2012, 63(11): 3640?3644.

[16] Tzima AK, Paplomatas EJ, Schoina C, et al. Successfulmediated transfor mation ofby optimizing multiple conditions. Fungal Biol, 2014, 118(8): 675?682.

[17] Lin X, Wang Y, Zhang S, et al. Functional integration of multiple genes into the genome of the oleaginous yeast. FEMS Yeast Res, 2014, 14(4): 547?555.

[18] Ma ZC, Chi Z, Geng Q, et al. Disruption of the pullulan synthetase gene in siderophore producingenhances siderophore production and simplifies sidero phore extraction. Process Biochem, 2012, 47(12): 1807?1812.

[19] Luo ZB, Zhang YJ, Jin K, et al. Construction ofT-DNA insertion mutant collections and identification of thermosensitive and osmosensitive mutants.Acta Microbiol Sin, 2009, 49(10): 1301?1305 (in Chinese).羅志兵, 張永軍, 金凱, 等. 球孢白僵菌T-DNA突變體庫的構(gòu)建及高溫和高滲敏感型突變體的篩選. 微生物學(xué)報(bào), 2009, 49(10): 1301?1305.

[20] Gostincar C, Ohm RA, Kogej T, et al. Genome sequencing of fourvarieties: biotechnological potential, stress tolerance, and description of new species. BMC Genomics, 2014, 15(1): 549.

(本文責(zé)編 郝麗芳)

-mediated transformation ofand high-efficient screening for polymalic acid producing strain

Guangwei Tu1,2, Yongkang Wang1,2, Jun Feng1,2, Xiaorong Li1,2, Meijin Guo3, and Xiang Zou1,2,4

1,,400715,2,400715,3,,200237,4,,,400044,

To develop a genetic transformation method ofand T-DNA insertion for high-efficient screening of polymalic acid (PMA) producing strain.-AGL1, containing the selection genes encoding hygromycin B phosphotase or phosphinothricin acetyltranferase, was used to transformCCTCC M2012223 and transformants were confirmed by colony PCR method. Transferred DNA (T-DNA) insertional mutants were cultured in microwell plate, and screened for high-titer PMA producing strain according to the pH response model. DNA walking was used to detect the insertion sites in the mutant. Results show that the selection markers could stably generated in the transformants, and 80 to 120 transformants could be found per 107single cells. A high-titer PMA mutant H27 was obtained, giving a good PMA production caused by the disruption of phosphoglycerate mutase, that increased by 24.5% compared with the control.-mediated transformation and high-efficient screening method were successfully developed, which will be helpful for genetic transformation ofand its functional genes discovery.

,, transformation, high-efficient screening, polymalic acid

December 1, 2014;

January 4, 2015

National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (Nos. 2015AA021005, 2014AA021205), Fundamental Research Funds for the Central Universities (Nos. XDJK2013B039, 2362014XK07), Visiting Scholar Foundation of Key Laboratory of Biorheological Science and Technology (Chongqing University), Ministry of Education (No. CQKLBST-2014-006).

Xiang Zou. Tel/Fax: +86-23-68251225; E-mail:zhx1030@swu.edu.cn

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃) (Nos. 2015AA021005, 2014AA021205)，中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金(Nos. XDJK2013B039， 2362014XK07)，重慶大學(xué)“生物流變科學(xué)與技術(shù)”教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室訪問學(xué)者基金 (No. CQKLBST-2014-006)資助。

2015-02-27

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20150227.1140.006.html