普鴻麗，呂波，趙東旭，李春

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重組β-葡萄糖醛酸苷酶鍵選擇性的半理性改造

普鴻麗，呂波，趙東旭，李春

北京理工大學(xué)生命學(xué)院，北京 100081

普鴻麗, 呂波, 趙東旭, 等. 重組β-葡萄糖醛酸苷酶鍵選擇性的半理性改造. 生物工程學(xué)報, 2015, 31(7): 1119–1128.Pu HL, Lü B, Zhao DX, et al. Semi-rational modification for improving bond selectivity of recombinant β-glucuronidase. Chin J Biotech, 2015, 31(7): 1119–1128.

為了提高重組表達(dá)的β-葡萄糖醛酸苷酶 (PGUS-E) 的鍵選擇性，本研究以PGUS-E結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的推測為指導(dǎo)，選擇了可能影響PGUS-E的鍵選擇性的R329、T369、N467位點進(jìn)行定點飽和突變，利用薄層層析 (TLC) 和高效液相色譜 (HPLC) 對鍵選擇進(jìn)行篩選，得到優(yōu)勢突變酶R329K、T369V。結(jié)果顯示：與PGUS-E酶相比，突變酶R329K、T369V鍵選擇性分別提高26.9%、34.3%。突變酶的酶學(xué)性質(zhì)研究表明，突變酶的最適pH和溫度與PGUS-E一致，但其酶催化效率下降。由此可見，R329、T369對酶催化的鍵選擇性和酶的活性有顯著影響。綜上結(jié)果，本文應(yīng)用飽和突變方法改善了PGUS-E 的鍵選擇性，為酶的結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系理解提供了實驗依據(jù)。

β-葡萄糖醛酸苷酶，單葡萄糖醛酸基甘草次酸，鍵專一性，定點飽和突變

甘草酸(Glycyrrhizin, GL) 又稱甘草甜素[1]，是一種三萜皂苷類化合物，由五環(huán)三萜皂苷通過β-1,2糖苷鍵和β-1,3糖苷鍵與兩個葡萄糖醛酸相連構(gòu)成。它具有抗炎、抗腫瘤、抗病毒等藥理效應(yīng)，同時作為甜味劑、增香劑、穩(wěn)定劑廣泛應(yīng)用于化妝品、食品等行業(yè)中[2-5]。但由于其極性較強，溶解性不好，不能有效地穿透細(xì)胞膜發(fā)揮藥效，使其應(yīng)用受到了很大的限制。與GL的相比，GL衍生物 (單葡萄糖醛酸基甘草次酸(Glycyrrhetinic acid monoglucuronide, GAMG)是一種甜度高、熱量低、安全性好的甜味劑，甜度是甘草酸的5倍多，蔗糖的941倍[6-7]，而且GAMG具有極性適中、溶解性好、易為人體吸收等特性，成為GL最理想的替代品。

β葡萄糖醛酸苷酶 (EC 3.2.1.31) 是一類能水解含有β葡萄糖醛酸基的糖苷類化合物，同時釋放出β-葡萄糖醛酸(GlcA) 和相應(yīng)的苷元的酶，主要分布于糖苷酶水解酶家族1 (GH1)、家族2 (GH2) 和家族79 (GH79)，同屬于糖苷酶氏簇A (GH-A)[8-9]，目前報道過的不同微生物來源的β葡萄糖醛酸苷酶性質(zhì)有所差異，但普遍存在酶表達(dá)效率不高、酶活性偏低、穩(wěn)定性差、存在副反應(yīng)等特點[10-11]，因此，如何獲得可以定向催化GL生成GAMG的β-葡萄糖醛酸苷酶成為甘草酸生物轉(zhuǎn)化的瓶頸。本實驗室前期在大腸桿菌原核系統(tǒng)中高效表達(dá)了來源于產(chǎn)紫青霉Li-3的β-葡萄糖醛酸苷酶(PGUS)[12-13]，但重組β-葡萄糖醛酸苷酶(PGUS-E) 的鍵選擇性相對于PGUS發(fā)生了改變，在水解GL的β-1,2糖苷鍵生成產(chǎn)物GAMG的同時亦會水解GAMG的β-1,3糖苷鍵生成副產(chǎn)物甘草次酸(GA)，造成產(chǎn)物GAMG專一性降低(圖1)。因此，利用蛋白質(zhì)改造技術(shù)研究并改造PGUS-E的鍵選擇性及產(chǎn)物專一性使其更好地適應(yīng)GAMG的工業(yè)化生產(chǎn)具有重要的應(yīng)用價值。相比較非理性設(shè)計中突變文庫大、篩選難度大等缺點[14-15]，通過蛋白結(jié)構(gòu)模擬和分析研究，將隨機突變限制在特定的區(qū)域上的半理性設(shè)計，可在較小的突變庫中獲得性質(zhì)改善的突變體[16]，近年來被廣泛的應(yīng)用于蛋白的定向改造。

本文以利用Pymol軟件對PGUS-E酶的模擬結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，理性預(yù)測活性中心氨基酸位點對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系的影響，最終選定3個突變位點R329、T369和N467進(jìn)行飽和突變，產(chǎn)生多樣化突變酶，通過薄層層析結(jié)合高效液相色譜篩選方法獲得鍵選擇性提高的突變酶R329K和T369V。對結(jié)果進(jìn)行分析討論，闡述了PGUS-E 酶的結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系，為酶分子的蛋白質(zhì)工程改造提供理論基礎(chǔ)和試驗依據(jù)，也為后續(xù)酶分子修飾及相關(guān)研究提供性質(zhì)更為優(yōu)良的酶源。

圖1 β-葡萄糖醛酸苷酶(PGUS-E)催化甘草酸示意圖

1 材料與方法

1.1 材料

1) 質(zhì)粒和菌株: 克隆及表達(dá)宿主TOP10由北京理工大學(xué)生命學(xué)院生物轉(zhuǎn)化與微生態(tài)課題組保存。含有目標(biāo)基因(GenBank登錄號：EU095019) 的組成型熱誘導(dǎo)質(zhì)粒pHCE-gus由本實驗室構(gòu)建。

2) 試劑：PCR反應(yīng)相關(guān)試劑DNA 聚合酶、dNTPs等購自購自TaKaRa公司；質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒購自北京博邁德科技發(fā)展有限公司；Ⅰ內(nèi)切酶購自Fermentas公司；DNA marker購自寶生物工程(大連) 有限公司；本實驗所用其他化學(xué)試劑均為分析純；PCR引物合成以及DNA測序由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

1.2 飽和突變法構(gòu)建突變體文庫

根據(jù)Statagene公司Quit-Change Kit原理，針對R329、T369、N467三位點設(shè)計了6條簡并引物(表1)。以質(zhì)粒pHCE-gus為模板，擴增出含有突變的質(zhì)粒。其中PCR的反應(yīng)體系組成為: 10×PCR緩沖液2.5 μL，4種dNTPs混合溶液2 μL，上下游引物各1 μL，pHCE-gus模板DNA 1 μL，5 U/μL的DNA聚合酶及無菌水適量，反應(yīng)總體積為25 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min 50 s，25個循環(huán)；72 ℃下延伸10 min。1% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR反應(yīng)產(chǎn)物，目標(biāo)條帶為7 269 bp。PCR產(chǎn)物中加入Ⅰ限制性內(nèi)切酶，在37 ℃酶解3 h以徹底消化甲基化原始模板，酶解產(chǎn)物采用熱擊法轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化液涂布于LB平板上(含有100 μg/mL氨芐青霉素)，得到飽和突變文庫。

表1 定點突變引物表

Underlined and bold sequences denote the coding sequence of the mutated amino acid (N=A/G/C/T; K=G/T).

1.3 酶的組成型表達(dá)及突變文庫篩選

將LB固體培養(yǎng)板上的單菌落逐個挑到每孔含有1 mL LB液體培養(yǎng)基 (含100 μg/mL氨芐青霉素；0.5 g/L底物GL) 的Ep管中，30 ℃、200 r/min轉(zhuǎn)速的搖床中培養(yǎng)表達(dá)24 h后迅速轉(zhuǎn)至40 ℃，熱誘導(dǎo)裂解細(xì)胞釋放PGUS-E到培養(yǎng)基中，與培養(yǎng)基中底物GL反應(yīng)24 h后，加10 μL的NaOH (1 mol/L) 終止反應(yīng)。反應(yīng)液中的底物GL和產(chǎn)物GAMG，GA通過TLC法進(jìn)行定性初篩，判斷標(biāo)準(zhǔn)如下：在GL轉(zhuǎn)化率相同的條件下(≥90%)，GAMG的積累量越高，則酶的鍵選擇性越高，對GAMG積累量高于PGUS-E酶的優(yōu)勢突變酶，用HPLC進(jìn)一步進(jìn)行定量復(fù)篩。

1.4 PGUS-E酶液制備及活性分析

將獲得的突變株接種于新鮮的LB培養(yǎng)基 (含100 μg/mL氨芐青霉素) 中30 ℃培養(yǎng)過夜，1% 接種量轉(zhuǎn)接于200 mL LB培養(yǎng)基，220 r/min 培養(yǎng)16 h后，將發(fā)酵液冷凍離心 (4 ℃， 5 000 r/min) 10 min，用醋酸緩沖液洗滌，重懸細(xì)胞，在冰浴中超聲破碎細(xì)胞 (300 W，工作2 s，間歇2 s，全程工作時間20 min)。破碎液于 12 000 r/min離心20 min收集上清，即為粗酶液。采用鎳親和層析對所得的粗酶液進(jìn)行分離純化。首先用pH 8.0的 Tris-HCl的緩沖液平衡鎳柱，通過上樣將粗酶液裝載到鎳柱上，然后清洗雜蛋白將基線280降至最低并沖平。最后分別用50和200 mmol/L的咪唑溶液梯度洗脫目的蛋白，最后將洗脫液透析除鹽即得到純酶。

取100 μL酶液加200 μL含有1 g/L甘草酸(pH=5.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液)，40 ℃反應(yīng) 60 min后，添加10 μL NaOH (1 mol/L) 終止反應(yīng)。取100 μL反應(yīng)液添加900 μL甲醇，混合均勻，用HPLC檢測GL、GAMG及GA的含量。β葡萄糖醛酸苷酶的活力定義為：在上述條件下每分鐘消耗1 nmol甘草酸所需要的β-葡萄糖醛酸苷酶量為一個活力單位(U)。

1.5 最適溫度和pH的測定

按上述方法測定突變酶在不同pH (3.0?8.0) 和溫度 (25?60 ℃) 下的酶活力，原始酶與突變酶分別設(shè)定最高酶活為100%，以相對酶活力和pH，溫度關(guān)系作圖，確定酶的最適pH和溫度。

1.6 PGUS-E突變酶的鍵選擇分析

采用高效液相色譜(HPLC) 對反應(yīng)混合物中底物GL及產(chǎn)物GAMG、GA進(jìn)行定量分析。儀器主要參數(shù)：島津LC-10A，色譜柱：Shim-pack, VP-ODS (150 mm，4.6 mm)，檢測器：SPD，檢測波長：254 nm，流動相：甲醇：0.6%醋酸＝81：19，進(jìn)樣量：10 μL，流速：1 mL/min，柱溫箱：40 ℃，工作站：LC solution。GL、GAMG、GA 的保留時間分別為5.2 min、11.7 min、 21.3 min。

數(shù)據(jù)處理計算公式如下:

轉(zhuǎn)化率 (CGL) =(SO–ST)/ SO×100%；

化學(xué)鍵選擇性(Scb)=PGAMG/(PGAMG+PGA) × 100%。

SO、ST分別代表底物GL的初始濃度和終濃度；PGAMG、PGA分別代表產(chǎn)物GAMG和GA的終濃度。

1.7 PGUS-E酶和突變酶的空間結(jié)構(gòu)模擬

PGUS-E酶的三維結(jié)構(gòu)通過SWISS-MODEL 蛋白模擬在線服務(wù)器 (http://www.expasy.ch/ swissmod/SWISS-MODEL.html) 進(jìn)行同源模擬獲得，模板為來源的β-葡萄糖醛酸苷酶(EGUS) 晶體結(jié)構(gòu)(PDB登錄號：3K46)，氨基酸序列比對結(jié)果顯示相似度達(dá)到54.34%。采用Pymol軟件理性分析和預(yù)測了活性中心氨基酸對PGUS-E鍵選擇性的影響，選取了突變位點。并且應(yīng)用該軟件虛擬氨基酸突變，通過分析突變前后氨基酸極性、疏水作用、氫鍵等的變化，分析結(jié)構(gòu)-鍵選擇性關(guān)系。闡述了PGUS-E的結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系，為進(jìn)一步的酶特性改造提供理論基礎(chǔ)。

2 結(jié)果與討論

2.1 PGUS-E酶鍵選擇性特異位點分析

PGUS-E 酶同源模擬獲得的理論結(jié)構(gòu)說明它包含一個(α/β)8桶狀催化結(jié)構(gòu)域，屬于(α/β)8水解酶亞組。(α/β)8類酶的活性部位均處于一個非常相似的位置，即位于連接β折疊鏈C端與α螺旋N端的環(huán)構(gòu)成的漏斗形口袋底部，參與底物結(jié)合和催化作用氨基酸在這個口袋中[17-18]。PGUS-E的糖苷底物分子GL和GAMG的糖基部分均為葡萄糖醛酸，配基則不同(圖2)，說明PGUS-E對GL和GAMG的末端糖苷鍵的糖基識別較強，對配基結(jié)構(gòu)識別性較低，可能導(dǎo)致鍵選擇性低。由此做出以下假設(shè)：糖苷鍵兩端結(jié)構(gòu)識別決定酶的鍵選擇性，通過與GL末端糖苷鍵的配基結(jié)構(gòu)識別相關(guān)的氨基酸突變可以提高PGUS-E酶鍵選擇性，最終使GAMG的產(chǎn)量提高。

大腸桿菌的β-葡萄糖醛酸苷酶(EGUS-E) 與PGUS-E同屬于GH2，其結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系為 PGUS-E的研究提供了有利參考。利用Pymol軟件對PGUS-E的模擬結(jié)構(gòu)與EGUS-E及葡萄糖醛酸復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu) (PDB登錄號：3K4D) 進(jìn)行比對，分析發(fā)現(xiàn)PGUS-E酶三維結(jié)構(gòu)中Arg329、His332、Thr369、Asp414、Asn467、Asp505、Trp550、Arg563、Lys567、Asn569 (圖3) 位于底物結(jié)合口袋中，說明這些氨基酸與底物分子的糖基或者配基識別結(jié)合相關(guān)。依據(jù)文獻(xiàn)報道，β-葡萄糖醛酸苷酶中，Asp414、Asp505為催化殘基[19]，參與糖苷鍵的斷裂，His332、Arg563、Lys567、Asn569位于糖基結(jié)合位點，與糖基識別相關(guān)[20-21]。在PGUS-E酶結(jié)構(gòu)中顯示，Trp550位于底物結(jié)合口袋的底部，是強疏水性氨基酸，保證催化反應(yīng)的疏水環(huán)境，Arg329、Thr369、Asn467位于糖基結(jié)合位點的對立面，可能與底物分子配基部分的識別相關(guān)。綜上分析，為了確保選擇位點的準(zhǔn)確性，最終選定與配基識別相關(guān)的3個位點 (Arg329、Thr369、Asn467) 進(jìn)行飽和突變研究，以提高PGUS-E酶鍵的選擇性。

圖2 PGUS-E酶底物分子的結(jié)構(gòu)示意圖

圖3 PGUS-E (綠)與EGUS復(fù)合物 (3K4D粉橙色)的結(jié)構(gòu)比對示意圖

2.2 突變文庫的構(gòu)建及篩選

利用帶有簡并密碼子的引物，以pHCE-gus 質(zhì)粒為模板，通過PCR擴增對R329、T369、N467進(jìn)行飽和突變，PCR擴增質(zhì)粒結(jié)果如圖4所示。將PCR產(chǎn)物經(jīng)過Ⅰ酶切消化轉(zhuǎn)化TOP10中，構(gòu)建了R329、T369、N467的飽和突變文庫。通過TLC定性初篩和HPLC定量復(fù)篩相結(jié)合的方法對突變文庫篩選，通過基因測序及序列分析獲得了優(yōu)勢突變酶R329K和T369V (圖5)。HPLC檢測結(jié)果計算獲得，原始的PGUS-E的轉(zhuǎn)化率達(dá)到90.1%時，鍵選擇性達(dá)到8.5%，T369V的轉(zhuǎn)化率達(dá)到90.3%時，鍵選擇性達(dá)到42.8%，與PGUS-E比較提升了34.3%；R329K的轉(zhuǎn)化率達(dá)到90.8%，鍵選擇性達(dá)到35.5%，與PGUS-E比較提升了26.9%。但N467位點飽和突變獲得的20種突變酶鍵選擇性并沒有提高，且催化GL的酶活力基本喪失。另外，對得到的R329K、T369V優(yōu)勢突變進(jìn)行組合，發(fā)現(xiàn)突變酶M3 (R329L/T369V) 的鍵選擇性并沒有進(jìn)一步與提高。

圖4 飽和突變PCR擴增DNA電泳圖

圖5 PGUS-E突變酶篩選結(jié)果

2.3 PGUS-E突變酶活性分析

對PGUS-E突變酶的比酶活進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)與PGUS-E比較，突變酶R329K、T369V催化GL水解能力下降。如圖6所示，突變酶 T369V (3273 U/mg) 的比酶活為PGUS-E (4726 U/mg) 的69.3%，突變酶R329K (1492 U/mg) 比酶活僅為PGUS-E的31.6%。

2.4 突變酶的最適pH合溫度的測定

為了確定酶反應(yīng)的最佳條件，考察了突變酶催化GL的最適pH和溫度，結(jié)果如圖7、8所示，突變酶T369V、R329K與PGUS-E的最適pH為5.0，最適溫度為40 ℃，說明突變氨基酸的引入并沒有影響酶的最適pH和最適 溫度。

圖6 PGUS-E酶及突變酶的比酶活

圖7 pH對PGUS-E及突變酶活力的影響

圖8 溫度對PGUS-E及突變酶活力的影響

2.5 突變酶的分析

為了進(jìn)一步確定突變酶的作用機制，采用Autodock軟件對酶與底物GL進(jìn)行對接模擬。圖9A?D依此為PGUS-E和T369V、R329K、N467D突變酶。

圖9A和圖9B比對顯示，突變酶T369V的第369位氨基酸由親水性蘇氨酸突變?yōu)槭杷岳i氨酸，極性變化影響369位氨基酸所在的整個Loop環(huán)構(gòu)象朝向疏水中心移動，增加了酶與GL的契合度，進(jìn)而增強了酶的鍵選擇性。但是酶與底物GL之間的范德華力的增強，使得催化反應(yīng)中結(jié)構(gòu)重排的自由能壘變大，影響了酶活性殘基的釋放，減緩了新一輪底物進(jìn)入活性中心速率，最終降低了酶催化效率。

圖9 PGUS-E和突變酶與GL作用的模擬結(jié)構(gòu)圖

圖9A和圖9C比對顯示，R329與E353和T504之間各存在一個氫鍵的相互作用。突變酶 R329K的第329位氨基酸由精氨酸變?yōu)橘嚢彼?，兩者具有相似的極性及電荷性質(zhì)，但側(cè)鏈變短，破壞了與E353和T504之間的氫鍵，引起 E505 位谷氨酸的位移，從而提高了酶的鍵選擇性。但是突變增加了催化位點與GL之間的距離，最終影響其催化效率。

圖9A和圖9D比對顯示，突變前N467分別與 E505 (催化殘基) 及T504之間形成一個氫鍵，且與兩者之間的距離很近，分別為1.3 ?和2.1 ?。故微小的變化影響催化殘基E505。這里以Asn長度和性質(zhì)變化最小的Asp進(jìn)行突變模擬，PGUS-E酶第467位天冬酰胺突變后，破壞了N467與E505之間的氫鍵，催化殘基E505與糖苷鍵結(jié)合構(gòu)象發(fā)生變化，嚴(yán)重影響PGUS-E的催化效率。結(jié)果分析表明N467對維持酶功能有重要作用。

3 結(jié)論

本實驗通過SWISS-MODEL軟件模擬了PGUS-E酶的三維結(jié)構(gòu)，通結(jié)構(gòu)比對，利用Pymol軟件分析了底物分子與酶之間的相互作用，初步確定影響其鍵選擇性的部分位點。通過構(gòu)建飽和突變文庫的研究，發(fā)現(xiàn)R329K和T369V突變使PGUS-E酶的鍵選擇性分別提高了26.9%，34.3%，突變酶催化GL生成的GAMG的產(chǎn)率和底物特異性增加。通過突變酶與底物GL作用的結(jié)構(gòu)模擬，進(jìn)一步分析了R329K和T369V鍵選擇性提高的機理，為進(jìn)一步鍵選擇性改善提供了理論依據(jù)。

本研究對于PGUS-E酶的結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系的分析和預(yù)測進(jìn)行了驗證和完善，為進(jìn)一步闡明PGUS-E酶的鍵選擇性與結(jié)構(gòu)關(guān)系奠定了基礎(chǔ)，同時為構(gòu)建具有理想鍵選擇性和產(chǎn)物特異性的PGUS-E酶突變體提供了新的出發(fā)點。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Semi-rational modification for improving bond selectivity of recombinant β-glucuronidase

Hongli Pu, BoLü, Dongxu Zhao, and Chun Li

,,100081,

To improve bond selectivity of recombinant β-glucuronidase in(PGUS-E), based on the PGUS-E structure guidance, three key points R329, T369 and N467 were identified to be responsible for the bond selectivity of PGUS-E, and further saturation mutagenesis was conducted. Two positive mutants R329K and T369V were obtained by a combined selection technique of thin-layer chromatography and high performance liquid chromatography. Compared to PGUS-E, the bond selectivity of mutants R329K and T369V increased by 26.9% and 34.3%, respectively; whereas the biochemical properties such as pH and temperature profile were unchanged. Nevertheless, the activity was decreased compared to PGUS-E. These results further confirmed that sites R329 and T369 played important roles for the bond selectivity and activity. In summary, this study significantly increased the bond selectivity of PGUS-E by structure guided saturation mutagenesis, providing experimental support for elucidating the relationship between the structure and function of PGUS-E.

βglucuronidase, glycyrrhetinic acid monoglucuronide, bond selectivity, site-saturation mutagenesis

December 2, 2014;

January 21, 2015

National Natural Science Foundation of China (Nos. 21176028, 21376028); National Science Fund for Distinguished Young Scholars of China (No. 21425624), Doctoral Fund of Ministry of Education of China (No. 20121101110050).

Chun Li.Tel/Fax: +86-10-68913171; E-mail: lichun@bit.edu.cn

國家科學(xué)自然基金(Nos. 20976014, 21376028)，國家杰出青年科學(xué)基金(No. 21425624)，高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金(No. 20121101110050) 資助。