宋書(shū)杰，熊智強(qiáng)，王勇

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利用合成調(diào)控RNA技術(shù)提高大腸桿菌異源合成紅霉素前體6-脫氧紅霉內(nèi)酯B產(chǎn)量

宋書(shū)杰1,2*，熊智強(qiáng)1*，王勇1

1中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院植物生理生態(tài)研究所 合成生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032 2上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院海洋藥物教研室，上海 200306

宋書(shū)杰, 熊智強(qiáng), 王勇. 利用合成調(diào)控RNA技術(shù)提高大腸桿菌異源合成紅霉素前體6-脫氧紅霉內(nèi)酯B產(chǎn)量. 生物工程學(xué)報(bào), 2015, 31(7): 1039–1049.Song SJ, Xiong ZQ, Wang Y. Enhancing erythromycin precursor 6-dEB production by using synthetic small regulatory RNAs in Escherichia coli. Chin J Biotech, 2015, 31(7): 1039–1049.

紅霉素為代表的聚酮類(lèi)化合物已經(jīng)成功的在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了異源合成，但其產(chǎn)量仍然較低(僅 ~10 mg/L)。本研究基于大腸桿菌全基因組代謝模型iAF1260，利用通量平衡分析預(yù)測(cè)了紅霉素母核6-脫氧紅霉內(nèi)酯(6-Deoxyerythronolide B, 6-dEB) 生物合成的關(guān)鍵靶點(diǎn)，通過(guò)合成調(diào)控RNA技術(shù)(Synthetic small regulatory RNAs, sRNAs) 對(duì)預(yù)測(cè)的靶點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明，以弱化(編碼LsrABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白) 和(編碼乙酸激酶蛋白) 為代表的關(guān)鍵靶點(diǎn)改造可以顯著提高6-dEB異源合成，提高幅度可達(dá)48.7%。通過(guò)弱化靶點(diǎn)的組合，進(jìn)一步改善了6-dEB的異源合成，產(chǎn)量最終可達(dá)22.8 mg/L，比出發(fā)菌株產(chǎn)量提高59.9%。本研究發(fā)現(xiàn)和確認(rèn)了6個(gè)有效的調(diào)控靶點(diǎn)，最終成功地改善了6-dEB在大腸桿菌中的異源合成。研究表明，通量分布比較分析結(jié)合sRNAs技術(shù)是一種有效的方法提高6-dEB異源合成，也為改善其他代謝產(chǎn)物的異源合成提供了可供借鑒的研究思路。

大腸桿菌，6-脫氧紅霉內(nèi)酯，異源合成，全基因組代謝模型，sRNA技術(shù)

紅霉素是目前聚酮類(lèi)化合物生物合成研究最為清楚的模式化合物，其生物合成途徑的建立和機(jī)制的解析，為異源生物合成獲得紅霉素或其衍生物奠定了基礎(chǔ)。在過(guò)去的十年中，大腸桿菌以其良好的異源基因表達(dá)特性和遺傳特性，越來(lái)越成為聚酮異源合成的主流通用宿主之一。通過(guò)合成生物學(xué)的設(shè)計(jì)，目前已經(jīng)解決了ACP修飾、前體供應(yīng)、紅霉內(nèi)酯環(huán)的后修飾等關(guān)鍵問(wèn)題[1-2]，實(shí)現(xiàn)了在大腸桿菌中的異源合成。其高效合成體系的設(shè)計(jì)，也做了諸多的嘗試：如為了提高質(zhì)粒穩(wěn)定性，2003年Murli等[3]用和基因整合到編碼甲基丙二酰輔酶A脫羧酶位點(diǎn)，同時(shí)用RSF1010的復(fù)制起始位點(diǎn)替換pET28a來(lái)源于pBR322的起始位點(diǎn)，將pBP144改造為pKOS207-129，獲得工程菌株K207-3/pKOS207-129/pBP130在搖瓶中可以獲得22.5 mg/L的6-dEB。Lau等[4]利用該菌株，在5 L生物反應(yīng)器中，以分批補(bǔ)料的方法進(jìn)行高密度培養(yǎng)，得到了1.1 g/L的6-dEB，這是到目前為止，6-dEB異源生物合成的最高紀(jì)錄。為了提高宿主本身的穩(wěn)定性，Wang等[5]將紅霉素聚酮合酶基因和通過(guò)染色體重組Red/ET方法整合入大腸桿菌染色體上，獲得了染色體修飾的穩(wěn)定菌株，與多個(gè)質(zhì)粒共表達(dá)相比，該菌株可穩(wěn)定的合成紅霉素中間體6-dEB。Wang等[6]在早期的研究中發(fā)現(xiàn)，在紅霉糖多胞菌中過(guò)量表達(dá)S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因?qū)t霉素的生物合成有促進(jìn)作用。通過(guò)在大腸桿菌中過(guò)量表達(dá)該基因，將大腸桿菌中6-dEB的產(chǎn)量提高了一倍[7]。此外，通過(guò)前體代謝工程手段，對(duì)大腸桿菌異源合成聚酮類(lèi)化合物做了一系列的定向合成嘗試[8]。

盡管以紅霉素為代表的聚酮異源生物合成獲得了巨大的進(jìn)展，但是仍然存在著諸多問(wèn)題。比如，目前無(wú)抗菌活性的紅霉素中間體6-dEB在高密度培養(yǎng)大腸桿菌中的效價(jià)約為1.1 g/L，而紅霉素的活性產(chǎn)物紅霉素A或紅霉素C在大腸桿菌中的效價(jià)卻低于1 mg/L。盡管有著發(fā)酵周期、遺傳操作等諸多優(yōu)勢(shì)，這一水平與紅霉素的原產(chǎn)株紅霉糖多孢菌相比，仍然有較大的差距(工業(yè)規(guī)模中，紅霉糖多胞菌產(chǎn)紅霉素A效價(jià)可達(dá)5?10 g/L)。本課題組通過(guò)基于全局代謝網(wǎng)絡(luò)模型的模擬計(jì)算發(fā)現(xiàn)[9]，在目前以大腸桿菌為宿主的紅霉素異源合成中，即使給予充足的丙酸前體，其中僅有約5%?10%的前體直接參與了聚酮的合成，而其他的前體即使供應(yīng)充足，也并不參與聚酮的生物合成。計(jì)算還發(fā)現(xiàn)，目前大腸桿菌合成聚酮化合物的實(shí)際產(chǎn)量?jī)H到了理論產(chǎn)量的1/10左右。這說(shuō)明復(fù)雜天然產(chǎn)物在底盤(pán)細(xì)胞中的異源合成仍有巨大的提升空間，絕不僅僅是引入新的合成途徑這樣簡(jiǎn)單。我們需要對(duì)這一復(fù)雜代謝網(wǎng)絡(luò)的本質(zhì)和作用規(guī)律有更深層次的認(rèn)識(shí)，以此指導(dǎo)設(shè)計(jì)更高效的異源合成系統(tǒng)。

近年來(lái)，基因組尺度代謝模型 (Genome- scale metabolic model，GSMM) 的提出[10]使菌種改造研究提升到系統(tǒng)的高度。隨著組學(xué)數(shù)據(jù)的日益豐富和完善，大腸桿菌、釀酒酵母等多個(gè)物種的全基因組代謝網(wǎng)絡(luò)模型得以重建。結(jié)合經(jīng)典的代謝網(wǎng)絡(luò)通量分析方法(如代謝通量分析(Metabolic flux analysis, MFA)[11-12]、通量平衡分析(Flux balance analysis, FBA)、最小代謝調(diào)整分析(Minimization of metabolic adjustment，MOMA)[13]等)，人們可對(duì)宿主細(xì)胞的代謝表型進(jìn)行模擬和預(yù)測(cè)，從而發(fā)現(xiàn)一些可能影響目標(biāo)化合物產(chǎn)量的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)；通過(guò)對(duì)這些節(jié)點(diǎn)實(shí)施改造可改變細(xì)胞代謝流的分布狀況，使得更多的碳架底物通向目標(biāo)產(chǎn)物的合成，從而改善目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量。在前期研究中，我們針對(duì)紅霉素合成關(guān)鍵中間體6dEB異源合成產(chǎn)率低的問(wèn)題(這也是目前異源合成普遍存在的問(wèn)題)，分析了其在不同異源宿主中的最大理論產(chǎn)率、影響理論產(chǎn)率的關(guān)鍵因素以及為提高產(chǎn)率而可能需要改造的潛在基因位點(diǎn)。

本研究中，我們基于Fiest等[14]構(gòu)建的基因組尺度代謝模型iAF1260，利用分析挖掘出了若干需要弱化的關(guān)鍵靶點(diǎn)基因。采用sRNA (Synthetic small regulatory RNAs) 技術(shù)，對(duì)擬下調(diào)的關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證(即在翻譯水平上通過(guò)sRNA干擾調(diào)控靶點(diǎn)基因的表達(dá)[15]，利用sRNA與靶基因的mRNA結(jié)合，從而阻遏靶基因的mRNA與核糖體的結(jié)合，繼而抑制靶基因的蛋白表達(dá))，并取得了良好的結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒及相關(guān)試劑

菌株DH10B作為克隆宿主，菌株WG (pZG07/pZG08) 為聚酮類(lèi)化合物紅霉素母核6-dEB的生產(chǎn)菌(表1)。分子克隆相關(guān)的酶、DNA片段與質(zhì)粒抽提純化試劑盒分別由NEB公司、TaKaRa公司及Axygen公司提供。培養(yǎng)基、抗生素及其他相關(guān)試劑購(gòu)自O(shè)xiod、國(guó)藥集團(tuán)與上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。引物由南京金斯瑞生物科技公司合成。

表1 本研究所用到的菌種和質(zhì)粒

1.2 sRNAs質(zhì)粒構(gòu)建

本研究采用sRNAs調(diào)控大腸桿菌染色體基因。質(zhì)粒構(gòu)建方法如下[16]：弱化靶點(diǎn)B (編碼磷酸戊糖變位酶)的sRNAs基因序列片段-sRNA (表2) (包括Pr啟動(dòng)子、靶基因結(jié)合位點(diǎn)和TE終止子，并在兩端分別引入Ⅰ和d Ⅲ酶切位點(diǎn))，由上海捷瑞生物工程有限公司直接化學(xué)合成。通過(guò)引物pACYC-F和pACYC-R，以pACYCDunet-1為模板，克隆得到只含氯霉素抗性和p15A復(fù)制子的載體片段，回收后采用Ⅰ和d Ⅲ雙酶切；同時(shí)采用Ⅰ和d Ⅲ雙酶切上述化學(xué)合成的-sRNA序列片段。清潔回收雙酶切后的載體片段和-sRNA片段通過(guò)T4DNA連接酶連接，得到模板質(zhì)粒pJF650。

以出發(fā)質(zhì)粒pJF650為模板，采用25 μL的PCR體系：2×GC 緩沖液I 12.5 μL，上下游引物各0.25 μL，dNTPs 2.5 μL，模板質(zhì)粒0.25 μL，LA酶0.25 μL，ddH2O將反應(yīng)體系補(bǔ)足至25 μL；利用表2中的引物，通過(guò)定點(diǎn)突變PCR擴(kuò)增直接獲得能夠弱化大腸桿菌中不同靶點(diǎn)基因表達(dá)的sRNAs質(zhì)粒。以構(gòu)建弱化靶基因的sRNA質(zhì)粒為例，采用表2中的tdcD-sRNA-F和tdcD-sRNA-R引物及上述PCR條件，以模板質(zhì)粒pJF650為模板，通過(guò)定點(diǎn)突變PCR直接將pJF650質(zhì)粒骨架靶基因結(jié)合位點(diǎn)突變成靶基因結(jié)合位點(diǎn)，得到能夠弱化基因的質(zhì)粒pSJ02。

表2 本研究所用到的引物

1.3 In silico模型的構(gòu)建與靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

通量分布比較分析典(Flux distribution comparison analysis, FDCA) 是建立在通量平衡分析(FBA) 基礎(chǔ)上的一種代謝通量分析方法，即是從代謝反應(yīng)的通量變化出發(fā)，上溯到相應(yīng)的基因，是一種自下而上(Bottom-up) 的算法。本研究采用大腸桿菌基因組尺度代謝模型iAF1260為計(jì)算模型，分別以生物量和最佳紅霉素母核6-dEB合成速率為目標(biāo)，進(jìn)行通量比較分析，計(jì)算相應(yīng)的代謝通量分布，找出差異顯著的節(jié)點(diǎn)(反應(yīng))，這些節(jié)點(diǎn)將成為影響紅霉素母核6-dEB合成的潛在改造靶點(diǎn)。

1.4 菌株的培養(yǎng)與發(fā)酵

1.4.1 菌株的培養(yǎng)

將sRNAs質(zhì)粒(以pACYCDuet-1作為對(duì)照) 轉(zhuǎn)化到6-dEB產(chǎn)生菌WG (pZG07/pZG08)中，挑取單菌落到含有氨芐青霉素100 μg/L、卡那霉素50 μg/L和氯霉素34 μg/L抗性的LB培養(yǎng)基(NaCl 10 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，甘油15 g/L) 中，37 ℃、250 r/min過(guò)夜培養(yǎng)，作為種子液備用。

1.4.2 菌株的發(fā)酵

發(fā)酵采用搖瓶培養(yǎng)：在100 mL三角搖瓶中加入10 mL發(fā)酵培養(yǎng)基[17](NaCl 10 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，甘油15 g/L， 100 mmol/L HEPES，pH 7.6，含有氨芐青霉素100 μg/L，卡那霉素50 μg/L，氯霉素34 μg/L，誘導(dǎo)劑異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG) 24 μg/mL，前體丙酸鈉20 μmmol/L)。將1%的種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于22 ℃、 250 r/min的搖床上發(fā)酵5 d，每個(gè)樣品3次平行。

1.5 分析檢測(cè)

菌體的生長(zhǎng)狀況使用比濁法測(cè)定，即用UV2000紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)λ=600 nm時(shí)測(cè)定菌液的吸光值A(chǔ) (600)。

發(fā)酵產(chǎn)物6-dEB利用HPLC-ELSD進(jìn)行分析檢測(cè)[18]，測(cè)定條件如下：色譜柱為T(mén)SK-100V (5 μm，4.6 mm×50 mm)，流速1 mL/min，流動(dòng)相為乙腈和水，采用50%乙腈等度洗脫。ELSD檢測(cè)器條件：漂移管溫度50 ℃，氣體流速 1.6 L/min，增益值8。

2 結(jié)果與分析

2.1 In silico預(yù)測(cè)關(guān)鍵基因靶點(diǎn)

FDCA方法是本課題組開(kāi)發(fā)的基于全基因組代謝模型新算法，依據(jù)本研究中FDCA方法描述，我們首先設(shè)定最大生物量和最大紅霉素母核6-dEB生物合成速率(預(yù)期菌株) 作為兩個(gè)獨(dú)立的目標(biāo)，進(jìn)行通量平衡分析，再對(duì)兩個(gè)設(shè)定目標(biāo)的基因尺度通量分布進(jìn)行比較，挖掘出大量潛在的代謝靶點(diǎn)(反應(yīng))[9]。基于6-dEB合成途徑的前體供應(yīng)代謝網(wǎng)絡(luò)，篩選出12個(gè)潛在需要弱化的基因靶點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證(表3)。

2.2 sRNAs技術(shù)弱化預(yù)測(cè)靶點(diǎn)

sRNAs技術(shù)[16]是一種新的細(xì)菌基因調(diào)控方法，主要在翻譯水平上利用sRNA干擾可以有效地弱化靶點(diǎn)基因的表達(dá)。本研究預(yù)測(cè)靶點(diǎn)的弱化驗(yàn)證是利用sRNAs技術(shù)來(lái)實(shí)施，由圖1A可知，與對(duì)照空質(zhì)粒pACYCDuent-1相比，單獨(dú)弱化12個(gè)靶點(diǎn)基因?qū)?xì)胞生長(zhǎng)都有輕微的促進(jìn)作用；例如弱化C基因的菌株600達(dá)到18 (對(duì)照菌600為15)。總體而言，弱化篩選的靶點(diǎn)對(duì)菌株生長(zhǎng)沒(méi)有顯著影響。

單獨(dú)弱化12個(gè)靶點(diǎn)基因?qū)λ拗鳟愒春铣?-dEB的影響卻有明顯差異(圖1B和1C)。實(shí)驗(yàn)表明，弱化、、、、和基因后宿主菌的6-dEB產(chǎn)量分別為21.3、19.6、18.6、18.2、17.8和17.2 mg/L，而對(duì)照菌僅為14.3 mg/L。6-dEB產(chǎn)量提高率分別為49%、37%、30%、28%、24%和20%。弱化、和基因位點(diǎn)，6-dEB產(chǎn)量分別為16.6、16.4和16.0 mg/L，產(chǎn)量提高為10%–20%。而弱化、和產(chǎn)量提高率小于10%。因此，大部分弱化靶點(diǎn)能夠提高6-dEB異源合成。由于弱化單個(gè)基因位點(diǎn)有效，我們推測(cè)組合弱化或同時(shí)弱化多個(gè)基因位點(diǎn)可能進(jìn)一步提高6-dEB異源合成。

表3擬弱化的基因位點(diǎn)

Table 3 The potential down-regulated sites

圖1 sRNAs弱化調(diào)控對(duì)E. coli合成6-dEB的影響

2.3 組合弱化調(diào)控基因位點(diǎn)

為了驗(yàn)證組合弱化調(diào)控能夠進(jìn)一步提高6-dEB異源合成，我們對(duì)與、、、、進(jìn)行了組合弱化實(shí)驗(yàn)。由圖2可知，同時(shí)弱化+、+、+雙基因位點(diǎn)，6-dEB產(chǎn)量達(dá)到22.8、21.49和 21.47 mg/L，其產(chǎn)量提高率為59.9%、50.4%和50.2%；而弱化+和+組合，6-dEB產(chǎn)量為14.08和20.98 mg/L，提高率為46.7%和1.3%。從比產(chǎn)率考察，弱化雙基因位點(diǎn)對(duì)比產(chǎn)率提高率都在20%以上，其中最高組合為+，比產(chǎn)率提高率為54%。與單獨(dú)弱化C基因位點(diǎn)產(chǎn)量相比，組合弱化+、+和+能夠進(jìn)一步提高生產(chǎn)菌的6-dEB異源合成能力。

圖2 組合弱化對(duì)異源合成6-dEB的影響

3 討論

大腸桿菌是目前生產(chǎn)紅霉素等聚酮類(lèi)化合物最具潛力的底盤(pán)細(xì)胞[9]，相關(guān)的研究也取得了一系列進(jìn)展[2,5,7-8,17-22]。但僅依靠單一靶點(diǎn)基因的改造或傳統(tǒng)的途徑工程改造等方法很難獲得更高效的紅霉素生產(chǎn)菌。隨著全基因尺度的代謝模型的發(fā)展，基于大腸桿菌全基因尺度調(diào)控來(lái)改善紅霉素異源合成成為可能?；蚪M尺度代謝模型[14]和不同算法[23-24]為挖掘更多的靶點(diǎn)以改善目標(biāo)產(chǎn)物合成提供了更多的機(jī)會(huì)。FDCA方法是基于FBA基礎(chǔ)上而發(fā)展成的通量比較分析方法[9]。本課題組[25]曾利用FDCA方法對(duì)大腸桿菌異源合成萜類(lèi)化合物前體供應(yīng)進(jìn)行計(jì)算分析和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，得到51個(gè)關(guān)鍵基因位點(diǎn)，改造后的菌株成功地使萜類(lèi)化合物在大腸桿菌中的產(chǎn)量提高174%。其中約20%的靶點(diǎn)是首次發(fā)現(xiàn)的新靶點(diǎn)。本研究基于基因組尺度代謝模型iAF1260進(jìn)行FDCA分析，成功地預(yù)測(cè)出提高6-dEB異源合成的靶點(diǎn)基因。證明了這一方法在預(yù)測(cè)新靶點(diǎn)方面的可靠性和可行性。

本研究通過(guò)sRNAs技術(shù)弱化改造宿主的染色體基因，成功改善了6-dEB的合成。研究結(jié)果表明，弱化一些靶點(diǎn)可顯著提高宿主合成6-dEB的能力。其中(編碼LsrABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)、(編碼磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)HPr蛋白) 和(編碼磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)PTSI蛋白) 是中重要的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白組分[26]；而靶點(diǎn)、和分別編碼脂肪酸氧化反應(yīng)復(fù)合體的α-單元、乙酸激酶和磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶。由于這些靶點(diǎn)并不處于6-dEB合成通路之中，其功能似與異源6dEB合成并無(wú)直接關(guān)聯(lián)，這些靶點(diǎn)的弱化可能間接影響了6dEB合成相關(guān)的前體物質(zhì)或輔因子供給，其提高6dEB合成的機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

sRNAs技術(shù)是最近發(fā)展的一種細(xì)菌基因弱化方法[16]，在翻譯水平上利用sRNAs與靶基因的mRNA結(jié)合，阻遏靶基因的mRNA與核糖體的結(jié)合，最終抑制靶基因的蛋白表達(dá)。相比基因敲除方法，它可以更加簡(jiǎn)單地對(duì)基因組中各基因進(jìn)行調(diào)控，也可以快速地、較高通量地同時(shí)對(duì)多個(gè)基因靶點(diǎn)進(jìn)行弱化，這也是這一方法的優(yōu)越性所在。與的模型預(yù)測(cè)相結(jié)合，這一方法展示出巨大的優(yōu)越性。Lee課題組[15-16]通過(guò)設(shè)計(jì)構(gòu)建表達(dá)sRNAs質(zhì)粒，將sRNA技術(shù)應(yīng)用到酪氨酸和尸胺cadaverine生產(chǎn)中，高通量篩選出有效改造靶點(diǎn)，使酪氨酸產(chǎn)量達(dá)到2 g/L以上，cadaverine生產(chǎn)菌產(chǎn)量提高了55%。因此，采用sRNAs技術(shù)可以有效的對(duì)調(diào)控靶點(diǎn)進(jìn)行表達(dá)弱化。隨著更多的細(xì)菌調(diào)控RNA發(fā)現(xiàn)和功能解析，相信sRNAs技術(shù)在細(xì)菌代謝工程和合成生物學(xué)上必將有著廣泛的應(yīng)用。

綜上所述，本研究基于的方法預(yù)測(cè)新靶點(diǎn)基因，利用sRNAs技術(shù)最終發(fā)現(xiàn)和確認(rèn)了6個(gè)有效的調(diào)控靶點(diǎn)，成功改善了6-dEB在大腸桿菌中的異源合成。這一策略和方法的成功，也為進(jìn)一步改善其他代謝產(chǎn)物的異源合成提供了研究思路。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Enhancing erythromycin precursor 6-dEB production by using synthetic small regulatory RNAs in

Shujie Song1,2*, Zhiqiang Xiong1*, and Yong Wang1

1 Key Laboratory of Synthetic Biology, Institute of Plant Physiology and Ecology, Shanghai Institutes for Biological Science, Chinese Academy of Science, Shanghai 200032, China 2 Marine Medicine Laboratory, College of Food Science & technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 200306, China

Although heterologous biosynthesis of polyketide erythromycin has been successfully achieved in, the titer remains at a very low level (~10 mg/L). In this study, based on genome-scale metabolic model of,method flux distribution comparison analysis was used to discovernovel potential targets for heterologous 6-dEB biosynthesis. Synthetic small regulatory RNAs (sRNAs) was used to experimentally test 12 down-regulated targets. The results showed that repression of each of these target genes e.g.andled to significantly improve heterologous 6-dEB biosynthesis. Using co-repression ofand, 6-dEB titer was improved by 59.9% in shake-flask with a maximum yield of 22.8 mg/L. This study indicates that combined flux distribution comparison analysis and synthetic small regulatory RNAs is an effective strategy to improve 6-dEB production in.

,6-deoxyerythronolide B, heterologous biosynthesis,genome-scale metabolic model, synthetic small regulatory RNAs

December 15, 2014;

January 30, 2015

National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2012AA02A701), National Basic Research and Development Program of China (973 Program) (No. 2012CB721104), National Natural Science Foundation of China (No. 31170101).

Yong Wang. Tel/Fax: +86-21-54924295; E-mail: yongwang@sibs.ac.cn

*These authors contributed equally to this study.

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃) (No. 2012AA02A701)，國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃 (973計(jì)劃) (No. 2012CB721104)，國(guó)家自然科學(xué)基金(No. 31170101) 資助。