趙慧霞 李秋文 董偉偉 段昕妤 朱建華 王如良 郝怡鑫 葉 明 肖文華

解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院腫瘤科，北京 100048

NDRG4（N-myc downstream-regulated gene 4）為抑癌基因NDRG基因家族成員[1]，該基因家族在人體多種其他正常組織中高表達(dá)，在某些腫瘤組織中不表達(dá)或低表達(dá)，低表達(dá)則可能與啟動(dòng)子高甲基化相關(guān)。大腸癌（colorectal cancer，CRC）是臨床最常見的惡性腫瘤之一[2-3]，在我國(guó)其發(fā)病率呈上升態(tài)勢(shì)，且晚期患者預(yù)后很差，5年總體生存率不到 15%，然而有關(guān)NDRG4基因與啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)在結(jié)直腸癌中的作用尚未得到闡明[4]。DNA甲基化常常是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的早期事件，因此，特異基因的甲基化可作為腫瘤早期診斷的分子標(biāo)志物。近年來研究認(rèn)為NDRG4基因存在于CRC腫瘤組織和體液中，且可能具有穩(wěn)定性高、可重生性，這為提高CRC的早期篩查[5-6]、早期診斷提供了一個(gè)全新的視角。本研究采用巢式甲基化特異性PCR（nested methylation specific PCR，nMSP）檢測(cè)結(jié)直腸癌血、尿、糞便NDRG4基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)。比較結(jié)直腸癌組織與糞便、尿、血中的NDRG4甲基化在早期診斷中的敏感性和特異性及其與結(jié)直腸癌臨床病理特征之間的關(guān)系，以探討其在結(jié)直腸癌早期診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本收集

取我院普外科2010年6月～2011年8月手術(shù)切除的84例患者的結(jié)直腸癌、癌旁組織，均經(jīng)病理證實(shí)；年齡為36～81歲，平均年齡53歲。并同期選擇相匹配的正常對(duì)照者30例（腹股溝疝患者和下肢靜脈曲張患者）。全部受檢者空腹抽血2 mL，EDTA-2Na 抗凝；同時(shí)留取晨尿 50～100 mL，糞便 100～200 mg，血、尿液、糞便標(biāo)本于手術(shù)前收集，收集后30 min內(nèi)送實(shí)驗(yàn)室。血、尿液、糞便立即提取基因組DNA，置于-20℃凍存?zhèn)溆?。大腸癌患者術(shù)后立即取材，癌組織、癌旁組織標(biāo)本，分裝并-80℃保存。所有患者在術(shù)前均未接受過化療、放療及免疫治療，所有研究對(duì)象均知情同意并簽署知情同意書。

1.1.2 主要試劑與儀器

組織DNA提取試劑盒：組織基因組DNA提取試劑盒（天根公司）；糞便DNA提取試劑盒：stool DNA Extraction Kit（Bioneer公司）；血DNA提取試劑盒：天根全血基因組DNA提取試劑盒、血漿游離DNA純化試劑盒（天根公司）；尿液DNA提取試劑盒：尿液基因組DNA快速提取試劑盒；亞硫酸鹽處理試劑 ：Wizard DNA Clean-up system、EZ DNA Methylation TM-Direct Kit（Promega 公司）；X-SssⅠ內(nèi) 切酶（英國(guó)NEB公司）；對(duì)亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的DNA進(jìn)行全基因組擴(kuò)增試劑盒：EpiTect Whole Bisulfitome Kit（德國(guó)Qiagen公司）；PCR 擴(kuò)增試劑：HotstarTaq DNA polymerase（德國(guó) Qiagen公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA的提取

1.2.1.1 組織DNA的提取 先將組織在液氮中研碎，再加入DNA提取緩沖液和蛋白酶K，于37℃消化直至液體變得清亮，然后參照說明書用飽和苯酚/氯仿溶液常規(guī)提取DNA。最后用紫外分光光度儀檢測(cè)純度及含量。

1.2.1.2 血漿、尿液、糞便DNA的提取 操作步驟按說明書進(jìn)行。DNA抽提后用紫外分光光度儀檢測(cè)純度及含量。

1.2.1.3 全血DNA的提取 用天根生化的全血基因組DNA提取試劑盒提取正常人外周血樣本中基因組DNA，操作步驟按說明書進(jìn)行。提取DNA后用SssⅠ處理的正常人淋巴細(xì)胞基因組作為陽(yáng)性對(duì)照，未經(jīng)處理的淋巴細(xì)胞基因組作為陰性對(duì)照。

1.2.2 基因組DNA的亞硫酸氫鹽修飾

組織基因組DNA參照Wizard DNA Clean-up system試劑盒進(jìn)行修飾；血、尿、糞便基因組DNA的亞硫酸氫鈉修飾：參照EZ DNA Methylation TM-Direct Kit試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.3 MDA對(duì)亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的DNA進(jìn)行全基因組擴(kuò)增

使用EpiTect Whole Bisulfitome Kit擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行全基因組擴(kuò)增，即取5 μL亞硫酸氫鈉修飾的DNA，加入5 μL滅菌水，再加入在冰上配制的1 μL REPLI-g Midi DNA polymerase和 29 μL EpiTect WBA Reaction Buffer反應(yīng)混合液，振蕩混勻，在28℃等溫全基因組擴(kuò)增反應(yīng)8 h，然后95℃5 min終止反應(yīng)，4℃保存。

1.2.4 巢式甲基化特異性PCR和電泳分析

NDRG4引物設(shè)計(jì)參考文獻(xiàn)[7]；引物序列、退火溫度和擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度（表1）；引物由上海生工生物工程有限公司合成。 PCR 體系包含 10 × Buffer 2.5 μL，TaqDNA 聚合酶 0．2 μL，dNTP 2 μL，一對(duì)外側(cè)上下游引物各1 μL，MDA擴(kuò)增的基因組DNA 2 μL，Mg2+0.5 μL，滅菌用水 15.8 μL。 同時(shí)設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照。外側(cè)PCR循環(huán)參數(shù)：95℃15 min，95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，以上步驟共 25 個(gè)循環(huán)，72℃延伸7 min。第二輪PCR使用兩對(duì)內(nèi)側(cè)引物分別擴(kuò)增，25 μL PCR 體系：10 × Buffer 2.5 μL，TaqDNA 聚合酶 0.2 μL，dNTP 2 μL，甲基化和未甲基化上、下游引物各 1 μL，外側(cè) PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物 2 μL 為模板，Mg2+0.5 μL，滅菌用水 15.8 μL。內(nèi)側(cè)PCR 循環(huán)參數(shù)：95℃ 15 min，95℃ 30 s，66℃ 30 s，72℃ 30 s，以上步驟共35個(gè)循環(huán)，72℃延伸7 min。經(jīng)上述兩次PCR擴(kuò)增后，將5 μL PCR產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并拍照。

表1 NDRG4基因的巢式甲基化特異性PCR引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 16.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌和癌旁組織NDRG4基因甲基化變化

在84例結(jié)直腸癌組織中，NDRG4基因甲基化發(fā)生率81.0%（68/84），而癌旁組織為 8.3%（7/84）；用于結(jié)直腸癌的組織學(xué)診斷的敏感性為81.0%（68/84），特異性則為91.7%（77/84）。

表2 NDRG4甲基化與結(jié)直腸癌臨床特征的關(guān)系

2.2 結(jié)直腸癌組織和糞便中NDRG4甲基化與臨床病理特征的關(guān)系

NDRG4甲基化與年齡、分化程度及TNM分期均無關(guān)，而與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，即有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤組織和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤組織糞便中的NDRG4表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05）。 見表2。

2.3 結(jié)直腸癌組織、糞便、尿、血中NDRG4基因甲基化比較

NDRG4基因甲基化檢測(cè)的敏感度、特異度分別為：血54.8%和 78.1%；尿 72.6%和85.0%；便 76.2%和 89.1%；組織81.0%和91.7%。在本研究分析的3個(gè)微量DNA標(biāo)本中，糞便和尿液基因甲基化診斷CRC的敏感度較高，特異性也較高，而血的特異性和敏感度較低（圖1）。因此基因甲基化檢測(cè)用于臨床時(shí)，需要聯(lián)合檢測(cè)尿、便基因，以保證診斷敏感度及特異度均達(dá)到較高水平。

圖1 nMSP檢測(cè)結(jié)直腸癌組織和糞便、尿、血NDRG4基因甲基化

3 討論

DNA序列測(cè)定表明，NDRG4基因長(zhǎng)32 kb，由17個(gè)外顯子及16個(gè)內(nèi)含子組成[8]。既往研究已證實(shí)NDRG4在成年人心、腦中表達(dá)明顯高于胎兒，提示NDRG4與心、腦發(fā)育有關(guān)。雖然在腫瘤中的作用還不清楚，但大量研究表明該基因與腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和轉(zhuǎn)移可能有一定關(guān)系。其基因5′端調(diào)控區(qū)域含有CpG島，在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過程中常常被甲基化，NDRG4基因甲基化被認(rèn)為是結(jié)直腸癌的重要生物學(xué)特征。Veerle等[7]最近發(fā)現(xiàn)NDRG4是候選腫瘤抑制基因和直腸癌的潛在生物標(biāo)志物，NDRG4啟動(dòng)子的甲基化可作為生物標(biāo)志物，用于糞便樣品檢測(cè)直腸癌，敏感性為61%，特異度為93%。本實(shí)驗(yàn)利用巢式甲基化特異性PCR（nMSP）檢測(cè)NDRG4甲基化狀態(tài)，在84例結(jié)直腸癌組織中，NDRG4基因甲基化發(fā)生率81.0%（68/84），而癌旁組織為8.3%（7/84）；診斷的敏感性為81.0%，特異性則為91.7%。在本研究分析的糞便、尿、血3個(gè)微量DNA標(biāo)本中，糞便和尿液基因甲基化診斷CRC的敏感度、特異性較高；而血的特異性和敏感度較低。

雖然腫瘤細(xì)胞可以釋放許多游離DNA到外周血、尿液中，但與腫瘤組織樣品相比，外周血血清樣品中DNA的量仍然是較低的（ng級(jí)），加之在用NaHSO3，修飾的過程中大部分DNA將被降解，因此，對(duì)于微量DNA樣品，普通MSP法的靈敏度仍需進(jìn)一步提高。本實(shí)驗(yàn)采用的MDA技術(shù)檢測(cè)NDRG4甲基化狀態(tài)，具有擴(kuò)增效率高，保真性能好的優(yōu)勢(shì)，是一種新興的全基因組擴(kuò)增技術(shù)，適合低含量腫瘤樣本甲基化狀態(tài)檢測(cè)。

對(duì)NDRG4基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)該檢測(cè)CpG位點(diǎn)腫瘤樣本組織和對(duì)應(yīng)的癌旁樣本組織甲基化率分別為81.0%和8.3%，由于所取癌旁樣本不是正常結(jié)直腸粘膜組織，發(fā)生一定程度甲基化，提示甲基化作用可能與結(jié)直腸癌發(fā)生密切相關(guān)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)該檢測(cè)CpG位點(diǎn)的甲基化率在年齡、分化程度及TNM分期差異均無顯著性，說明甲基化與結(jié)直腸癌的發(fā)展過程中并非起主要作用，可能只在結(jié)直腸癌的發(fā)生早期發(fā)揮作用。

本實(shí)驗(yàn)利用巢式甲基化特異性PCR（nMSP）檢測(cè)NDRG4甲基化狀態(tài)，結(jié)直腸癌糞便中的甲基化的敏感度為76.2%，特異度為89.1%；尿液敏感度72.6%，特異度85.0%，這說明糞便和尿液中的NDRG4甲基化有極大可能被作為早期檢測(cè)結(jié)直腸癌的非侵入性生物標(biāo)志物。且NDRG4無論來源于尿液還是糞便樣本，均易于采集，穩(wěn)定性強(qiáng)，不易被降解，重復(fù)性及特異性高，使得其有很大可能成為臨床診斷的敏感指標(biāo)。因此，本研究結(jié)果有望能夠豐富結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制并為將來臨床上將NDRG4甲基化在結(jié)直腸癌中作為一個(gè)新的診斷靶點(diǎn)提供一定理論基礎(chǔ)。

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