郭夢媛 皇甫輝 王丹丹 韓 瑞 李 卓 趙 軼

山西醫(yī)科大學第一臨床附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科，山西太原 030000

喉鱗狀細胞癌是呼吸道最常見的惡性腫瘤之一，大量研究顯示趨化生長因子受體4（CXCR4）在某些腫瘤組織中有著過量的表達，通過SDF-1/CXCR反應軸控制腫瘤細胞遷徙和靶器官特異性表達[1-2]。而基質金屬蛋白酶-13（MMP-13）在趨化因子生物軸的下游激活途徑中有其結合位點，從而促進磷酸化，使作用增強[3]。本文研究采用免疫組織化學方法和逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）方法檢測CXCR4和MMP-13的蛋白及mRNA在喉鱗狀細胞癌及其正常黏膜組織中的表達情況，探討CXCR4和MMP-13在喉癌淋巴結轉移中的作用。

1 材料與方法

1.1 一般資料

免疫組化方法選擇我院耳鼻喉科2009年10月～2011年9月喉鱗癌切除后存檔的蠟塊，共70例，患者年齡為34～76歲，平均（56.7±6.7）歲，其中男 60 例，女 10 例；RT-PCR 方法選擇2010年7月～2011年9月喉鱗癌切除后的新鮮組織，共 30 例，患者年齡為 36～72 歲，平均（55.9±6.2）歲，其中男25例，女5例。以上臨床資料均完整，患者術前未接受放化療。收集10例癌旁正常喉黏膜的新鮮組織做為對照組，一部分石蠟包埋用于免疫組化，另一部分置于滅菌的錫箔紙內，投入液氮罐內，隨后放入深低溫（-86℃）冰箱中保存，用于RT-PCR技術實驗用。

1.2 免疫組織化學方法

CXCR4和MMP-13均以兔抗人多克隆抗體（武漢博士德生物技術有限責任公司）。實驗嚴格按照試劑盒說明書操作。結果均由兩位病理主治醫(yī)師共同閱片得出。CXCR4和MMP-13蛋白均以細胞漿呈有棕黃色顆粒為陽性，每張切片觀察5個具有代表性的高倍鏡視野，根據染色部位的染色強度和染色細胞百分率進行評分：基本不著色為0分，著色淡者為1分，著色深者為2分；著色細胞占計數細胞百分率＜5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，＞50%為3分。將每張切片的著色強度得分和著色細胞百分率得分相乘，為其最后得分。0～1分為陰性（-），≥2分為陽性。

1.3 RT-PCR方法

采用Trizol試劑提取總RNA，引物設計應用primer 5.0軟件，序列及合成的產物大小為：CXCR4上游：5′-CGGAA TTCCAGCAGGTAGCAAAGTGACG-3′，下游：5′-GACGCCAAC ATAGACCACCT-3′；擴增長度為 561 bp；MMP-13 上游：5′-GACTTCACGATGGCATTGCTG-3′，下游：5′-GCATCAACCTGCTGAGGATGC-3′；擴增長度為491 bp；以GAPDH為內參對照。 反應體系均為 94℃ 3 min，94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃90 s 35個循環(huán)，72℃5 min；產物以1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，照相并分析。

1.4 統計學方法

應用SAS 6.12進行數據的分析，計量資料數據以均數±標準差（±s）表示，比較采用t檢驗，計數資料采用百分率表示，組間對比采用χ2檢驗，并進行線性相關分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫組化結果

2.1.1 CXCR4及MMP-13在喉鱗癌與正常黏膜中的表達 由表1可見，CXCR4及MMP-13在喉鱗癌中表達的陽性率明顯高于正常黏膜組織。CXCR4和MMP-13在喉鱗狀細胞癌中表達于腫瘤細胞的細胞質及細胞膜，呈陽性或強陽性，而在正常喉黏膜上皮細胞中呈弱陽性或陰性，見圖1～4。

圖1 CXCR4在正常組織中的表達（免疫組化，×200）

圖2 CXCR4在癌組織中表達（免疫組化，×200）

2.1.2 喉鱗癌中CXCR4及MMP-13在不同臨床病理特征的表達 由表2可見，喉鱗癌CXCR4蛋白的表達與腫瘤的分期、分化程度及淋巴結轉移有關，喉鱗癌MMP-13蛋白的表達與腫瘤的分化程度及淋巴結轉移有關（P＜0.05），CXCR4及MMP-13均與年齡和性別無關。

圖3 MMP-13在正常組織中的表達（免疫組化，×200）

圖4 MMP-13在癌組織中表達（免疫組化，×200）

2.1.3 喉鱗癌中CXCR4及MMP-13蛋白表達的相關性分析 對喉鱗癌中CXCR4及MMP-13蛋白的表達進行相關性分析，結果顯示二者呈正相關（r=0.45，P＝0.012 5）。

2.2 RT-PCR結果

2.2.1 CXCR4與MMP-13在喉鱗癌組與正常黏膜組中mRNA的表達 CXCR4 為（1.25±0.28）、（0.55±0.19），鱗癌組與正常組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；喉鱗癌組與正常黏膜組中MMP-13 mRNA 的表達分別為（1.10±0.21）、（0.04±0.01），差異有統計學意義（P＜0.05）。CXCR4及MMP-13在喉鱗癌和正常黏膜中mRNA表達情況經逆轉錄PCR擴增條帶結果，見圖 5～6。

2.2.2 喉鱗癌中CXCR4和MMP-13 mRNA在不同臨床病理特征中的表達 喉鱗癌CXCR4和MMP-13 mRNA的表達量與腫瘤的分化程度及淋巴結轉移有關（P＜0.05）。見表3。

表3 喉鱗癌中趨化生長因子受體4及基質金屬蛋白酶-13 mRNA在不同臨床病理特征的表達（±s）

表3 喉鱗癌中趨化生長因子受體4及基質金屬蛋白酶-13 mRNA在不同臨床病理特征的表達（±s）

臨床病理特征 例數 CXCR4 t值 P值 MMP-13 t值 P值分化程度高、中分化低分化淋巴結轉移13 17 0.99±0.26 1.45±0.25 6.570.026 30.85±0.21 1.29±0.20 6.020.028 4無有16 14 1.09±0.24 1.43±0.22 5.760.034 20.94±0.23 1.28±0.19 5.780.034 0

2.2.3 喉鱗癌中CXCR4及MMP-13 mRNA表達的關系 經線性相關分析，喉鱗癌中CXCR4及MMP-13 mRNA的表達呈正相關（r=0.42，P ＝ 0.027 5）。

3 討論

腫瘤的生長與擴散是重要的生物學行為，而蔓延與遠處轉移是惡性腫瘤細胞和細胞外基質成分共同參與的一個復雜而有序的過程，細胞外基質的降解及腫瘤細胞的轉移是必不可少的過程。CXCR4是一類表達于不同細胞上含有7個跨膜區(qū)的G蛋白偶聯受體，SDF-1是CXCR4的唯一配體，研究顯示某些腫瘤組織CXCR4有著過量的表達，控制白細胞對腫瘤的浸潤，調節(jié)腫瘤血管生成，激活宿主對腫瘤細胞的特異性免疫應答，以自分泌或旁分泌的方式刺激腫瘤細胞的增殖，通過SDF-1/CXCR4反應軸控制腫瘤細胞遷徙和靶器官特異性表達[4]。SDF-1/CXCR4生物學軸的活動表現為細胞內儲備鈣的調動及MAPK（絲裂原結合蛋白酶）的活化，伴其下游信號分子的磷酸化[5]。腫瘤發(fā)生發(fā)展是一個多步驟、多基因調控的復雜過程，癌細胞從原發(fā)病灶脫落后，需突破細胞外基質和基底膜組成的結構屏障，才能向周圍組織侵襲或進入脈管中，引發(fā)轉移[6-7]，在此過程中，起作用的有基質金屬蛋白酶家族。CXCR4在腫瘤發(fā)展過程中可以引起MMPs的磷酸化，使腫瘤細胞分泌更多的MMPs。MMP-13是基質金屬蛋白酶家庭的重要成員，是1994年首先從人類乳腺癌細胞中分離出來的，在MMPs激活過程中起關鍵作用，可激活其他亞型的MMPs，在腫瘤侵襲和轉移中具有重要作用[8-9]。如MMP-13在激活其他MMP的過程中還具有催化自身的作用，可促進活性MMP-9的產生，在此過程中MMP-13處于中心地位[10]，MMP-13水平的微小改變或活性的增強，都可能放大整個下游的蛋白分解作用，從而降解細胞外基質和基底膜對組織產生破壞。

表1 趨化生長因子受體4及基質金屬蛋白酶-13在喉鱗癌與正常喉黏膜中的表達[n（%）]

表2 趨化生長因子受體4及基質金屬蛋白酶-13的表達與喉鱗癌臨床病理特征的關系[n（%）]

圖5 CXCR4基因在不同喉組別中的表達

圖6 MMP-13基因在不同喉組別中的表達

本實驗通過采用免疫組織化學方法和RT-PCR方法檢測喉鱗癌組織及癌旁正常黏膜組織中CXCR4及MMP-13蛋白和mRNA的表達，免疫組織化學檢測結果顯示CXCR4及MMP-13在喉鱗癌組織中的蛋白表達率分別為71.43%和74.29%，明顯高于正常黏膜組（P＜0.01）。結果還表明，CXCR4蛋白表達水平與腫瘤分期、分化程度及淋巴結轉移有關，MMP-13蛋白表達水平與腫瘤分化程度及淋巴結轉移有關，但與腫瘤分期無關，本研究結果的出現可能與病例選擇或例數較少有關。二者蛋白表達均與腫瘤的分化程度及淋巴結轉移密切相關（P＜0.05），與患者年齡、性別無關，提示CXCR4和MMP-13可能在喉癌的形成和發(fā)展過程中有一定的作用，與喉癌淋巴結的侵襲和轉移有關。并通過Rt-PCR結果顯示，CXCR4和MMP-13在喉癌組織中mRNA表達明顯高于癌旁正常黏膜（P＜0.05），在分化程度及淋巴結轉移中表達水平有統計學意義（P<0.05），這一結果與免疫組化結果相一致，由于分化程度與淋巴結轉移均與患者的預后相關，因此CXCR4及MMP-13蛋白和mRNA可能有助于判斷患者的預后，即CXCR4及MMP-13蛋白和mRNA高表達患者的預后差，進而通過檢測兩者的表達來預測喉癌的早期轉移和復發(fā)。

本研究還通過對CXCR4和MMP-13蛋白的表達進行相關性分析，二者呈正相關（r=0.45，P=0.012 5），同時，CXCR4和MMP-13 mRNA表達的相關分析與蛋白表達相同（r=0.42，P=0.027 5）。說明在喉鱗癌中CXCR4及MMP-13在蛋白和mRNA水平上都具有協同正向作用，提示二者在喉鱗癌的發(fā)生發(fā)展中具有明顯的促進作用。

綜上所述，喉鱗癌組織中CXCR4和MMP-13在蛋白水平及mRNA水平均升高，二者共同促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展，可通過術后聯合檢測CXCR4及MMP-13蛋白和mRNA的表達來評估喉癌的浸潤轉移、術后復發(fā)等，有可能對判斷預后有一定價值。

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