孫立業(yè) 毛 璇 張冬娟 孫 博 管又飛 顏賢忠

1.軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院，北京 100853；2.國家生物醫(yī)學(xué)分析中心，北京 100850；3.北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部生理學(xué)與病理生理學(xué)系，北京 100083

糖尿病腎?。―N）是糖尿病最常見和最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，同時(shí)也是導(dǎo)致終末期腎損害的重要因素[1]。目前，臨床上對糖尿病腎病的診斷主要依賴于對尿微量白蛋白排泄率（UAER）的檢測，但因?yàn)槟蛭⒘堪椎鞍椎暮繒芊逝?、胰島素抵抗等諸多因素影響而存在著局限性[2]。糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制目前尚無統(tǒng)一定論，當(dāng)前研究主要集中在糖代謝、脂代謝、氧化應(yīng)激[3-5]等方面。代謝組學(xué)作為一種全面研究生物機(jī)體或組織細(xì)胞動態(tài)代謝的技術(shù)手段，近年來在疾病的診斷、標(biāo)志物篩查以及發(fā)病機(jī)理的研究等方面已有廣泛的應(yīng)用[6-8]。本文采用基于核磁共振（NMR）的代謝組學(xué)技術(shù)對db/db糖尿病腎病小鼠血漿中內(nèi)源性小分子代謝物進(jìn)行分析，結(jié)合模式識別技術(shù)確定糖尿病腎病小鼠機(jī)體由于病理刺激而產(chǎn)生的代謝紊亂，進(jìn)行潛在代謝標(biāo)志物分析，并對其病理機(jī)制進(jìn)行探討，為臨床的診療提供可能的新思路，新方法。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組

糖尿病腎病模型db/db小鼠（試驗(yàn)組）6只，體重（53.9±2.1）g；db/m 小鼠（對照組）6 只，體重（26.8±2.3）g。所有小鼠均為雄性，周齡為14～16周，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部提供。動物飼養(yǎng)房12 h晝夜交替，溫度為25～27℃，動物自由攝食飲水。

1.2 試劑和儀器

重水（D2O）購自美國 Norell公司；2，2，3，3，三甲基甲硅烷基丙酸（TSP）購自加拿大默克公司；戊巴比妥鈉和肝素鈉購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。VarianUNITYINOVA 600 MHz超導(dǎo)脈沖傅立葉變換核磁共振譜儀，購自美國瓦里安公司；Eppendorf 5810R離心機(jī)，購自德國Eppendorf公司。

1.3 血漿樣本制備和處理

對小鼠進(jìn)行解剖，各組小鼠用戊巴比妥鈉（2%，2.5 mL/kg）麻醉后，于心臟動脈取血，使用肝素鈉抗凝，3 500 r/min離心15 min后得到血漿，取250 μL血漿，13 000 r/min離心10 min，取上清液 200 μL，加入 100 μL 的 TSP 重水溶液（1 mg/mL）和300 μL D2O，渦旋混勻后加入至5 mm核磁管中，用于核磁共振檢測。

1.4 核磁共振數(shù)據(jù)采集與預(yù)處理

于27℃下，使用VarianUNITYINOVA 600 MHz超導(dǎo)脈沖傅立葉變換核磁共振譜儀采集血漿核磁共振一維1H譜，采用Carr-Purcell-Meiboom-Gill（CPMG）序列抑制由蛋白和脂蛋白等物質(zhì)產(chǎn)生的寬峰，檢測血漿中的小分子代謝物，實(shí)驗(yàn)主要參數(shù)如下：譜寬8 000 Hz、弛豫延遲時(shí)間2 s、采樣點(diǎn)數(shù)64 K、累加次數(shù)64次，采用預(yù)飽方式抑制水峰信號。FID信號經(jīng)過傅立葉變換轉(zhuǎn)換為一維1H NMR譜圖，調(diào)整相位并進(jìn)行基線校正后以乳酸雙峰左側(cè)峰定標(biāo)，化學(xué)位移定為δ1.33。將δ4.4～0.4范圍內(nèi)的譜圖按照每段δ0.002進(jìn)行分段積分，再將積分按每張譜的總積分強(qiáng)度為10 000進(jìn)行歸一化，所得數(shù)據(jù)輸出并轉(zhuǎn)換到Excel文件后保存。

1.5 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用 MATLAB R2008a（The MathWorks，Inc.，Natick，MA，USA）軟件對積分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行對齊，采用多元統(tǒng)計(jì)分析軟件SIMCA-P12.0+（Umetrics AB，Umea，Sweden）對對齊后的數(shù)據(jù)進(jìn)行模式識別分析及皮爾森（Pearson）相關(guān)性分析，數(shù)據(jù)在進(jìn)行單位方差（UV scaling）預(yù)處理之后采用正交偏最小二乘判別法（OPLS-DA）進(jìn)行分析[9]，采用七折交叉驗(yàn)證法[10-11]（seven-fold cross-validation）來驗(yàn)證模型的有效性，用R2X和R2Y的值表示模型擬合情況，Q2值表示模型的預(yù)測能力。最后利用MATLAB R2008a軟件做出相關(guān)系數(shù)圖，更直觀也更客觀的發(fā)現(xiàn)組間差異代謝物。

2 結(jié)果

2.1 1H核磁共振譜圖

圖1顯示的為兩組小鼠血漿的核磁共振1H譜，其中A為對照組db/m小鼠，B為試驗(yàn)組db/db小鼠。主要代謝物已在圖中進(jìn)行了標(biāo)注，從譜圖中可以明顯觀察到db/db小鼠血漿中葡萄糖顯著升高。

圖1 db/m小鼠（A）與db/db小鼠（B）血漿1H核磁共振譜圖

2.2 多元統(tǒng)計(jì)分析

為了更準(zhǔn)確客觀地分析兩組間的差異代謝物，筆者采用了OPLS-DA的方法對數(shù)據(jù)進(jìn)行了多元統(tǒng)計(jì)分析，并用交叉驗(yàn)證的方法對模型的預(yù)測能力進(jìn)行評估（R2X=0.452，R2Y=0.992，Q2=0.879）。利用MATLAB軟件做相關(guān)系數(shù)圖，相關(guān)系數(shù)的臨界值相當(dāng)于顯著性水平P=0.05，查閱相關(guān)系數(shù)r臨界值表確定臨界值為0.755，即|r|＞0.755的積分段所代表的代謝物在兩組間有差異。圖2B中顏色越接近紅色，代表此信號對組間區(qū)分貢獻(xiàn)越大，方向則表示含量的增加與減少。從圖2A中可以觀察到兩組小鼠可以被明顯區(qū)分，圖2B則顯示了引起組間差異的代謝物，與對照組db/m小鼠相比，db/db小鼠血漿中葡萄糖和氧化三甲胺（TMAO）的含量升高，脂蛋白、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、乳酸、丙氨酸、賴氨酸、乙酸、谷氨酰胺、蛋氨酸、檸檬酸、肌酸、肌酐、甘油磷酸膽堿、磷酸膽堿、甘油的含量則下降。見表1。

圖2 db/db（▲）及db/m（■）小鼠血漿核磁共振1H譜的 OPLS-DA結(jié)果

3 討論

糖尿病腎病是導(dǎo)致終末期腎臟疾病的主要原因，也是糖尿病主要的死亡原因之一，因此，對于糖尿病腎病的早發(fā)現(xiàn)早治療是至關(guān)重要的。目前，臨床上對糖尿病的診斷主要依靠UAER方法，但這是一個(gè)不可逆的過程，當(dāng)患者出現(xiàn)UAER升高時(shí)往往已經(jīng)伴隨心血管并發(fā)癥及其他腎臟疾病，錯(cuò)過了最佳治療時(shí)機(jī)。筆者利用基于核磁共振的代謝組學(xué)技術(shù)較全面的對樣本中各類代謝物種類及含量的變化特點(diǎn)進(jìn)行分析，尋找出主要的差異代謝物，對于輔助臨床早期診斷是有重要意義的。

本文的研究結(jié)果顯示，糖尿病腎病小鼠血漿內(nèi)多種代謝物含量發(fā)生變化，多條代謝通路受到影響。試驗(yàn)組小鼠血漿中的檸檬酸含量降低，提示三羧酸循環(huán)可能受阻，這一結(jié)果在zuker大鼠[12]和核受體PPAR-缺失小鼠[13]中已有發(fā)現(xiàn)。db/db小鼠血漿中多種氨基酸含量發(fā)生變化，如亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸、賴氨酸、谷氨酰胺、蛋氨酸、甘氨酸，說明糖尿病腎病小鼠體內(nèi)存在氨基酸代謝異常，可能是由于腎小管的重吸收能力下降，導(dǎo)致大量氨基酸流失。其中甘氨酸作為抗氧化劑，可以延緩氧自由基對腎臟的損害，通過調(diào)節(jié)腎臟抗氧化酶、Na+-K+-三磷酸腺苷酶、脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛和一氧化氮等物質(zhì)的水平來保護(hù)腎臟[14]。而db/db小鼠血漿中甘氨酸含量明顯減少，說明腎臟已受到損傷。

TMAO一般作為腎小管受損的標(biāo)志物[15]，在本實(shí)驗(yàn)中試驗(yàn)組小鼠血漿內(nèi)TMAO含量顯著升高，提示著腎臟出現(xiàn)損傷，這一變化在db/db小鼠腎組織中同樣有所體現(xiàn)[16]。肌酸、肌酐含量的降低可能是由于發(fā)生糖尿病腎病時(shí)，由于高血壓血管緊張蛋白酶代謝紊亂而引起了腎小球?yàn)V過速率改變，進(jìn)而造成腎皮層血流改變[17]。血漿中乙酸鹽含量降低，與Salek等[18]報(bào)道一致。磷酸膽堿和甘油磷酸膽堿含量降低與Chen等利用高分辨魔角旋轉(zhuǎn)技術(shù)檢測的8周齡db/db小鼠肝臟內(nèi)的變化一致[19]。磷酸膽堿是屬于構(gòu)成細(xì)胞膜的主要成分，試驗(yàn)組小鼠血漿中含量的降低也提示著腎損傷。用代謝組學(xué)手段對血漿中小分子代謝物進(jìn)行分析為進(jìn)一步研究糖尿病腎病提供了更全面的信息。

表1 db/db小鼠與db/m小鼠血漿中主要差異代謝物及譜峰歸屬

本文采用用基于核磁共振的代謝組學(xué)方法對db/db糖尿病腎病模型小鼠的血漿進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示，與對照組db/m小鼠相比，試驗(yàn)組db/db小鼠血漿內(nèi)多種代謝物含量發(fā)生了變化，體現(xiàn)在一些已知的腎損傷的標(biāo)志物TMAO、肌酸等，同時(shí)發(fā)現(xiàn)亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸、賴氨酸、谷氨酰胺、蛋氨酸、甘氨酸等氨基酸含量降低，提示糖尿病腎病出現(xiàn)時(shí)，由于腎損傷而出現(xiàn)的腎小管重吸收能力下降，會導(dǎo)致氨基酸的流失，這些氨基酸將可能作為新的潛在代謝標(biāo)志物。除此之外，糖尿病腎病小鼠可能還存在著三羧酸循環(huán)受阻，即能量代謝紊亂。以上結(jié)果表明，代謝組學(xué)技術(shù)能夠更全面的反映生物體的代謝變化，幫助人們更好地了解生物體中各種復(fù)雜的代謝通路，這有可能成為一種輔助糖尿病腎病臨床診斷以及病理機(jī)制探討的重要手段。

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