孫世曉 楊添淞 趙偉麗 趙楠 田明

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)·哈爾濱 150040）

前言 中藥延胡索在臨床應(yīng)用已有上千年歷史，早在《雷公炮炙論》即記載“心痛欲死，速覓延胡”，［1］。該藥目前在臨床上常用于治療心肌缺血、心絞痛、心律失常、早搏等，具有顯著療效。實(shí)驗(yàn)資料表明，

延胡索能影響冠狀動(dòng)脈血流量、心肌收縮力和心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，并能減輕心肌壞死程度，改善壞死邊緣區(qū)心肌的營(yíng)養(yǎng)供血［2、3、4、5］，但在目前，針對(duì)延胡索總生物堿抗心肌細(xì)胞凋亡的研究尚未見(jiàn)報(bào)道，故本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了相關(guān)研究，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 材料動(dòng)物

70只健康成年Wistar大鼠，體重220±20g,雌雄各半，購(gòu)于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK黑2008-004；儀器：PCR儀，Image-ProPlus5.0圖像分析系統(tǒng)，GIS凝膠成像分析系統(tǒng)，高速冷凍離心機(jī)，動(dòng)物呼吸機(jī)。藥品：鹽酸普萘洛爾，批號(hào)；0901209，天津力生制藥股份有限公司生產(chǎn)；延胡索總生物堿由中藥實(shí)驗(yàn)室自行提取，經(jīng)光譜比色檢測(cè)并計(jì)算其純度達(dá)到60%，試劑：TUNEL試劑盒，rTaq酶，bax、bcl-2和caspase-3引物，B-Actin。以上試劑購(gòu)于上海生工生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 分組與給藥 隨機(jī)分為7組：正常組、假手術(shù)組(只穿線不結(jié)扎)、模型組，延胡索總生物堿低劑量(0.5mg／kg)組、中劑量(1.Omg／kg)組、高劑量(2.Omg／kg)組、鹽酸普萘洛組；(0.5mg／kg)組，每組10只。各組連續(xù)灌服給藥14天，其中假手術(shù)組、模型組給予灌服等體積蒸餾水。

1.2.2 造模 末次灌胃1小時(shí)后，除對(duì)照組、假手術(shù)組外，其余各組通過(guò)冠狀動(dòng)脈結(jié)扎復(fù)制急性心肌缺血大鼠模型。

1.2.3 心臟標(biāo)本采集 在冠脈結(jié)扎3小時(shí)后處死大鼠，立即取出心臟用冰鹽水清洗并除掉周圍大血管、左右心房、右心室及結(jié)締組織，在心臟結(jié)扎線以下平行冠狀溝將心室橫斷切成5片，將第2片放入4%多聚甲醛固定液中4℃固定24小時(shí)，制作石蠟切片用于TUNEL檢測(cè)：第3片放入液氮中凍存，用于RTPCR檢測(cè)。

1.2.4 TUNEL檢測(cè) 取大鼠心肌組織石蠟切片，二甲苯脫蠟，乙醇梯度入水，蛋白酶K消化，0.01MPBS沖洗，0.3%H202,處理，50u1TUNEL反應(yīng)混合液孵育，DAB顯色，蘇木素淡染，烤干后樹(shù)膠封片。用光鏡在200倍視野下隨機(jī)取10個(gè)視野，經(jīng)Image-Pro Plus5.0圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描，以染色強(qiáng)度計(jì)算凋亡陽(yáng)性細(xì)胞百分率。

1.2.5 RT-PCR檢測(cè) 取大鼠心肌組織50～lOOmg置研缽中研磨，加Trizol試劑后轉(zhuǎn)移至rppendorf管中，12000rpm、4℃離心取上清液，加三氯甲烷混勻，12000rpm、4℃再次離心取水相，加異丙醇混勻，12000rpm、4℃離心后棄上清液，加無(wú)水乙醇漂洗沉淀，7500rpm、4℃離心后棄上清液，測(cè)定RNA純度，然后配制RNA標(biāo)準(zhǔn)液并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。Bcl-2上 游 引 物 為：CCCTGGCATCTTCTCCTTC，下 游 引 物 為：CATCTCCCTGTTGACGCTC；Bax上 游引物為：GAAGCTGAGCGAGTGTCTCC，下游引物為：GATCAGCTCGGGCACTTTAG；Caspase-3上 游 引 物為：TCTGACTGGAAAGCCGAAACTC， 下 游 引 物 為：ACGGGATCTGTTTCTTTGCATG。以β-actin作為內(nèi)參照。用含溴化乙錠的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，GIS凝膠成像分析系統(tǒng)拍照并對(duì)產(chǎn)物條進(jìn)行分析。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)方法 以上結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，統(tǒng)計(jì)處理用SPSS11.5軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果

以上結(jié)果見(jiàn)表1和圖1、圖2、圖3。

表1：延胡索總生物堿對(duì)急性心肌缺血大鼠細(xì)胞凋亡的影響(±S，n=10)

表1：延胡索總生物堿對(duì)急性心肌缺血大鼠細(xì)胞凋亡的影響(±S，n=10)

注：與正常組比較：·P

caspase-3基因相對(duì)表達(dá)量正常組 0.3±0.02 0.45±0.09 0.27±0.03 0.07±0.03假手術(shù)組 0.2±0.03 0.43±0.06 0.25±0.02 0.06±0.03模型組 13.5±0.25* 0.15±0.03* 0.52±0.07* 0.19±0.02*高劑量組 5.8±0.07#◇ 046+0.030#◇ 0.16±0.05#◇ 0.08±0.05#◇中劑量組 5.1±0.12#◇ 0.43±0.08#◇ 0.18±0.03#◇ 0.08±0.06#◇低劑量組 9.1±0.35# 0.35±0.06# 0.23±0.04# 0.12±0.02#陽(yáng)性藥組 5.7±0.11#◇ 0.44±0.04#◇ 0.16±0.05#◇ 0.07±0.03#◇組 別凋亡陽(yáng)性細(xì)胞百分率(%)bcl基因相對(duì)表達(dá)量bax基因相對(duì)表達(dá)量

與正常組比較，模型組心肌細(xì)胞凋亡陽(yáng)性率增多P<0.01；與模型組比較，延胡索總生物堿高、中、低劑量組和普萘洛爾組心肌細(xì)胞凋亡陽(yáng)性率減少P

3 討論

研究表明［6、7］，在心臟生理、病理的發(fā)展過(guò)程中，能夠引起心肌細(xì)胞產(chǎn)生凋亡的原因多種多樣，有機(jī)械刺激、細(xì)胞因子、超負(fù)荷鈣離子、氧自由基、細(xì)菌毒素、缺氧等，因此，心肌細(xì)胞凋亡現(xiàn)象是普遍存在的。已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，急性心肌缺血也能誘發(fā)心肌細(xì)胞產(chǎn)生凋亡，如Saraste在研究中發(fā)現(xiàn)［8］，大鼠冠狀動(dòng)脈結(jié)扎后1h內(nèi)，心肌細(xì)胞無(wú)丟失現(xiàn)象，結(jié)扎2h后，心肌細(xì)胞出現(xiàn)凋亡和壞死，細(xì)胞凋亡高峰發(fā)生在結(jié)扎5h后，細(xì)胞壞死高峰發(fā)生在結(jié)扎24h后，該結(jié)果提示大鼠冠狀動(dòng)脈結(jié)扎后，早期心肌損傷以凋亡為主，后期以壞死為主，說(shuō)明細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死在急性心肌缺血中是相互獨(dú)立的。傳統(tǒng)觀念認(rèn)為，急性心肌缺血所致的心機(jī)損傷主要是心肌壞死，但現(xiàn)在已經(jīng)清楚，急性心肌缺血時(shí)還存在心肌細(xì)胞凋亡發(fā)生。心肌細(xì)胞屬于終末期分化細(xì)胞，幾乎無(wú)再生能力［9］，如果能設(shè)法抑制急性缺血后心肌細(xì)胞凋亡，增加存活心肌細(xì)胞數(shù)量，無(wú)疑會(huì)有利于防治心肌缺血和促進(jìn)心功能的恢復(fù)，這對(duì)患者的長(zhǎng)期預(yù)后非常有益。

目前認(rèn)為，心肌細(xì)胞凋亡有兩種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑［10、11］：即細(xì)胞表面死亡受體途徑和線粒體死亡途徑。細(xì)胞表面死亡受體途徑與腫瘤壞死因子和Fas啟動(dòng)有關(guān)，線粒體死亡途徑則是由Bcl-2家族成員激活而引起。Bcl-2家族成員分為兩個(gè)亞族，即抗凋亡蛋白亞族和前凋亡蛋白亞族，前者包括Bcl-2和Bcl-xL，后者包括Bax、Bak、Bid和Bad等。在正常情況下，Bc1-2家族的大部分抗凋亡蛋白一般作為細(xì)胞器膜(如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核膜)的整合膜蛋白被隔離起來(lái)，而前凋亡蛋白則以非活性的形式定位分布于胞液中或細(xì)胞質(zhì)骨架上，當(dāng)有凋亡刺激時(shí)，前凋亡蛋白成員發(fā)生加工修飾，易位于線粒體外膜上，引起線粒體通透性和膜電位改變，釋放細(xì)胞色素C、凋亡誘導(dǎo)因子等，啟動(dòng)半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶(Caspases)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，激活Caspase-3使細(xì)胞產(chǎn)生凋亡。

本實(shí)驗(yàn)觀察了延胡索總生物堿對(duì)急性心肌缺血模型大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響，同時(shí)觀察了各組bcl-2、bax和caspase-3基因表達(dá)的變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組心肌細(xì)胞凋亡陽(yáng)性率明顯增多，延胡索總生物堿高、中、低劑量組心肌細(xì)胞凋亡陽(yáng)性率明顯減少，模型組bcl-2基因相對(duì)表達(dá)量減少，bax和caspase-3基因相對(duì)表達(dá)量增多，延胡索總生物堿高、中、低劑量紐bcl-2基因相對(duì)表達(dá)量增多，bax和caspase-3基因相對(duì)表達(dá)量降低。以上結(jié)果表明，延胡索總生物堿高、中、低劑量具有抗急性心肌缺血模型大鼠心肌細(xì)胞凋亡作用，該作用與調(diào)節(jié)bcl-2、bax和caspase-3基因表達(dá)有關(guān)。

［1］李時(shí)珍:本草綱目(上).人民衛(wèi)生出版社，2006，555.

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