劉 峰 ，柳 港 ，王 帥 ，王 濱 ，蹇兆成 ，孫業(yè)全

（1.濰坊醫(yī)學院，山東 濰坊 261053；2.濰坊醫(yī)學院附屬醫(yī)院，山東 濰坊 261053）

腎癌是最常見的腎實質(zhì)惡性腫瘤，約占成人惡性腫瘤的2%～3%，各國或各地區(qū)的發(fā)病率不同，發(fā)達國家發(fā)病率高于發(fā)展中國家[1]。盡管根治性手術(shù)切除為其主要治療方法，但仍有40%的腎癌確診時已有遠處轉(zhuǎn)移，手術(shù)機會率低。目前，隨著介入技術(shù)的廣泛開展，經(jīng)導管腎動脈化療栓塞術(shù)作為腎癌根治術(shù)前及中晚期腎癌治療的輔助措施，已廣泛應用于臨床，療效顯著，可減少術(shù)中出血及術(shù)中可能引起的腫瘤擴散，使腫瘤縮小，緩解癥狀，延緩病情發(fā)展[2]，提高手術(shù)切除率。本研究對兔VX2腎移植瘤模型進行TACE治療，栓塞后7 d處死動物取出瘤塊，免疫組化染色檢測腫瘤細胞增生核抗原（Proliferating cell nuclear antigen,PCNA）的表達。為臨床TACE治療腎癌的療效評價提供了分子水平的切實有效的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

新西蘭大白兔22只，雄性，體質(zhì)量2.5～3.0 kg，由山東省農(nóng)業(yè)技術(shù)科學院動物實驗中心提供（許可證號：sxk-魯-2009-0013）。

1.2 VX2瘤細胞株

瘤細胞傳代兔由協(xié)和醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院提供（許可證號：scxk-京-2009-0014）。

1.3 實驗藥品及器材

3%戊巴比妥鈉，阿霉素，70%復方泛影葡胺，碘化油；1.5T磁共振，介入導管機。

1.4 動物模型建立

采用開腹直視下瘤塊埋植法建立兔腎腫瘤動物模型。建模2周后經(jīng)超聲檢查，將適合介入治療的動物隨機分為實驗組和對照組。

1.5 介入操作

將實驗動物隨機分為兩組，對照組10只，實驗組12只。DSA監(jiān)視下，經(jīng)股動脈穿刺插管至腎動脈，造影明確導管在靶血管后，實驗組：2 mg/kg阿霉素、0.2 mL/kg超液態(tài)碘油充分混勻后經(jīng)微導管緩慢注入，栓塞腫瘤；對照組：經(jīng)導管注入10 mL生理鹽水（圖1）。

1.6 取材及免疫組織化學染色

腫瘤治療后7 d耳緣靜脈空氣栓塞處死動物，留取腫瘤標本（周邊包含少許正常的肝組織），沿軸位最大徑將瘤塊一分為二用10%福爾馬林固定，包埋蠟塊時即以此最大徑為切面，若瘤塊過大則在此最大徑切面上分別取瘤塊中心和周邊的組織（或中心壞死灶周圍和瘤塊周邊的組織）進行包埋，5 μm連續(xù)切片，進行免疫組化染色（PCNA，北京中杉，PV9002法，抗體濃度1∶80）。陽性標準為陽性細胞染色為黃色或棕黃色，定位于細胞核內(nèi)；在高倍鏡下（×400）隨機抽取腫瘤非壞死區(qū)域計數(shù)5個高倍視野各200個細胞，分別記數(shù)陽性細胞，按公式：PCNA陽性細胞增殖指數(shù)（Proliferation index,PI）=PCNA陽性細胞數(shù)/腫瘤細胞數(shù)，計算PI[3]。

1.7 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計學軟件SPSS 11.5進行統(tǒng)計學處理，P<0.05時差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 PCNA的表達情況

PCNA陽性染色表現(xiàn)為細胞核有棕黃色顆粒。對照組PCNA染色陽性細胞彌漫分布或片狀分布，且周邊比腫瘤中心表達略強，癌旁組織散在表達，但表達較弱（圖2）；TACE組腫瘤中心部分壞死，部分標本腫瘤壞死部分內(nèi)散在的表達，但腫瘤周邊部分細胞增殖核抗原表達增強，細胞核增大深染（圖3）。

2.2 PCNA的量化數(shù)據(jù)及統(tǒng)計分析

將通過計數(shù)得出的PI值較后得出：對照組（61.2±11.21）%與 TACE 組（71.6±11.01）%之間具有顯著差異性（P=0.041）（表1），即對照組中 PCNA 的表達強度低于TACE組。

3 討論

PCNA亦稱周期素，是聚積在S期細胞核內(nèi)復制的細胞周期依賴性蛋白，是DNA多聚酶δ的輔助蛋白，與細胞周期緊密相關，PCNA在G1期開始增加，S期達到高峰，G2期下降，M期降至最低，且與患者預后有關[4]。作為一個內(nèi)源性增殖細胞的標記物，PCNA與癌組織的增殖活性、轉(zhuǎn)移及預后關系密切。

表1 PI在各組中的分布情況（）

表1 PI在各組中的分布情況（）

注：1：與對照組比較，P<0.05。

組別 例數(shù) PI（%） t值 P值對照組 10 61.2±11.21 TACE 組 12 71.6±11.011 2.184 0.0411

3.1 腫瘤細胞增殖活性的檢測

PCNA對DNA復制的調(diào)節(jié)起重要作用，PCNA的合成與表達與細胞增殖密切相關，是反映細胞增殖的主要生物學指標，并調(diào)控細胞周期。免疫組化染色的顯色系統(tǒng)是將二抗和酶通過一個多聚糖骨架聯(lián)接成一個多聚體，直接放大信號一倍，是目前公認的一種有效、敏感地進行細胞增殖的定量檢測方法。

免疫組化研究表明，PCNA在細胞核中有兩種形式：一種是可溶性，可溶于乙醇等有機溶劑而被洗脫，經(jīng)過處理的組織和細胞中可以消失，在細胞周期中，它的量不發(fā)生變化；另一種是不溶性，不溶于有機溶劑，是復制所必需的，它的出現(xiàn)明顯與細胞增殖有關。因為參與細胞周期循環(huán)、復制和修復，所以凡進入增殖周期的細胞在凋亡檢測中均為陽性反應。故可有效地根據(jù)陽性細胞的多少反映腫瘤細胞的PI[5-6]，進而反映細胞增殖狀況。細胞PI越高，反映細胞的周期越短，并且其在各種腫瘤中均能穩(wěn)定地表達，在大部分正常組織中不表達或僅有十分微弱的表達。理論上，腫瘤的分化程度與腫瘤的預后是密切相關的，而這種周期性變化恰好與細胞增殖過程相似[7-8]。因此，細胞PI被認為是反映細胞分裂程度、衡量細胞增殖進程的相同步的客觀評估指標，不僅能反映腫瘤細胞的增殖活性，同時也與腫瘤細胞的分化程度及患者預后有關。在腫瘤理論的研究中，一般認為腫瘤分化越低，增殖力越強，惡性程度越高，其過度表達越強[9]。本研究參考文獻應用免疫組化染色（PV9002法）檢測PCNA的表達取得了理想的實驗結(jié)果。

3.2 TACE治療后兔VX2肝移植瘤組織中PCNA的表達

在我們的實驗免疫組化結(jié)果顯示2組共22只實驗動物中PCNA均有表達，陽性率為100%，TACE組（71.6±11.01）%PI明顯高于對照組（61.2±11.21）%（表1），與Huang等[10]報道肝癌經(jīng) TACE治療后殘留癌的PCNA標記指數(shù)增高的觀點一致。經(jīng)TACE治療后殘留癌的PCNA標記指數(shù)增高，其原因可能與以下幾方面有關：①腎移植瘤經(jīng)TACE治療后可發(fā)生程度不等的腫瘤壞死，在腫瘤邊緣或多或少地存在殘留癌，殘留癌中新生腫瘤細胞所占比例增大；這個部位的腫瘤生長最活躍，使G0期的細胞進入細胞分裂周期中，處于S期的癌細胞增加，即相應地PCNA表達量也增加[4]。②栓塞后新生血管的形成，側(cè)支循壞的建立，這主要是由于TACE治療后腫瘤缺氧、壞死，缺氧與壞死組織又可刺激血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等的分泌[11]，VEGF與其特異性受體結(jié)合后，受體首先自磷酸化，繼而激活磷脂酞膽堿特異性磷脂酶 C（PLCy）、水解磷脂酞肌醇二磷酸（PIP2），產(chǎn)生二脂酞甘油（DAG）和肌醇三磷酸（IP3），其中DAG可激活胞漿中蛋白激酶C（PKC）并固定于膜上，然后誘導內(nèi)皮細胞生長，參與細胞外蛋白水解和基底膜的降解，利于血管內(nèi)皮細胞的遷移和增生，促進了血管形成。③VEGF又叫血管滲透因子，它不但可以促進腫瘤新生血管的形成還可增加血管的通透性。VEGF通過一種小泡囊狀細胞器（VVO）引起內(nèi)皮細胞窗開放并維持這種狀態(tài)，從而導致微血管特別是毛細血管后靜脈和小靜脈的滲透性增加。其增加微血管通透性的能力是組織胺的5萬倍，VVO由許多小囊和空泡相互連接成葡萄樣結(jié)構(gòu)，從管腔膜一直延伸到基底膜，并與窗隔相連，當窗開放時，生物大分子即可通過基底膜漏出，引起腫瘤血管中的血漿蛋白、纖維蛋白和其他循環(huán)大分子的外滲，形成富含纖維的細胞外基質(zhì)，這種臨時基質(zhì)支持成纖維細胞和內(nèi)皮細胞的內(nèi)生，成纖維細胞和內(nèi)皮細胞又可將臨時基質(zhì)轉(zhuǎn)化為成熟的腫瘤基質(zhì)，從而為腫瘤細胞生長創(chuàng)造了物質(zhì)條件。Mei等[12]也報道VEGF的表達與腫瘤瘤細胞的增殖和凋亡有關。

兔VX2腎移植瘤成功率比較高，選擇合適的治療時機和治療方案進行介入治療，能夠取得理想的療效，是一個研究腎癌介入治療的理想的動物模型，實驗組術(shù)后腫瘤大部分發(fā)生壞死。本實驗采用免疫組化法檢測腫瘤PCNA的表達，發(fā)現(xiàn)TACE術(shù)后殘余的腎癌組織細胞PI升高。

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