王秀元，趙 華，蔣玲波，方 益，張薇英，王萍亞

（1.浙江海洋學院食品與藥學學院、醫(yī)學院，浙江舟山 316004；2.浙江舟山市質量技術監(jiān)督檢測研究院，浙江舟山 316021）

腌制是一種傳統(tǒng)的加工保藏方法，可以提高食品的防腐性能，延長保質期，改善產(chǎn)品風味，其在水產(chǎn)品加工中應用頻繁。腌制水產(chǎn)品因其風味獨特，深受世界各地人民的青睞[1－3]。但腌制水產(chǎn)品的安全性問題頗具爭議，特別是腌制水產(chǎn)品的過程中，會產(chǎn)生含有致癌作用的亞硝酸鹽和由此轉化生成的N－亞硝胺類化合物[4－6]。相關文獻資料表明，人類是N－亞硝胺引起癌癥的易感群體[7]。在習慣吃腌制水產(chǎn)品的沿海地方，鼻咽癌和胃癌發(fā)病率非常高。針對此現(xiàn)象許多學者研究了某些地區(qū)的海產(chǎn)品中硝酸鹽、亞硝酸鹽、N－亞硝胺的含量調(diào)查，結果從腌制水產(chǎn)品中檢測到了不同水平的強致癌物質N－亞硝胺[8－10]。

目前國內(nèi)外對腌制水產(chǎn)品中N－二甲基亞硝胺（NDMA）、N－二乙基亞硝胺（NDEA）的研究較多[11－12]，GB2762－2005《食品中污染物限量》規(guī)定了腌制生食水產(chǎn)品中NDMA、NDEA的限量標準分別為NDMA≤4 μg/kg，NDEA≤7 μg/kg[13]，但常用的方法分析時間長，“氣相色譜－熱能分析儀”使用率低，因此本研究建立一種適用于腌制水產(chǎn)品中多種N－亞硝胺的高靈敏度快速檢測方法。

1 材料與方法

1．1 儀器與試劑

1．1．1 主要儀器

氣相色譜－質譜聯(lián)用儀（GC/MS），Agilent GC7890A/MS5975C，美國Agilent公司；固相萃取裝置，美國VISIPRETMDL；高速冷凍離心機，SER JSE09L31，USA；數(shù)控超聲波清洗器，KQ5200DE，昆山市超聲波儀器有限公司。

1．1．2 試劑

標準品：N二甲基亞硝胺（純度98．0%）由美國CIL提供；N－二乙基亞硝胺（純度99．9%）、N－二丙基亞硝胺（純度99．9%）由美國SUPELCO公司提供；二氯甲烷：色譜純；無水硫酸鈉：分析純。

1．2 試驗方法

1．2．1 色譜條件

色譜柱：DB－WAX，30 m×0．250 mm×0．25 μm；進樣口溫度：250 ℃；載氣：He（純度＞99．999%）；隔墊吹掃流量：3 mL/min；不分流進樣；升溫程序：起始溫度50℃，保持3 min，以10℃/min升溫至110℃，再以15℃/min升溫至200℃，再以40℃/min升溫至240℃；自動進樣，進樣量1 μL。

1．2．2 質譜條件

電離方式：電子轟擊（EI）離子源；電子能量：70 eV；電子倍增器電壓：1 671 V；離子源溫度：230℃；四極桿溫度：150℃；接口溫度：240℃；SIM采集模式，掃描質量范圍：m/z 40～350；溶劑延遲：4 min；采樣頻率：2。

上述條件下，3種N－亞硝胺的保留時間和定性定量離子見表1。

表1 3種N－亞硝胺物質的保留時間和定性定量離子表Tab．1 Retention time and GC/MS acquisition parameters for three N－nitrosamines

1．2．3 標準溶液制備

分別準確稱取3種N－亞硝胺標準品0．1 g（精確到0．000 1 g），用二氯甲烷定容至50 mL，得到N－亞硝胺標準儲備液，濃度為2．0 mg/mL。準確移取上述標準儲備液，以二氯甲烷逐級稀釋配制N－亞硝胺：10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、1 000 ng/mL 系列混合標準溶液，按 1．2．1 色譜條件和 1．2．2 質譜條件上機進樣，進樣量1 mL，以混合標準品濃度為橫坐標，對應的峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

1.2.4 樣品溶液制備及前處理

稱取粉碎的腌制水產(chǎn)品樣品20.0 g，置于50 mL具塞離心管中，加入二氯甲烷30 mL，于IKA振藥器上渦旋1 min，保持溫度在30℃以下超聲提取30 min，低溫條件下離心10 min，分出有機相溶劑，再提取2次，每次約20 mL二氯甲烷，合并有機溶劑相，通過固相萃取技術凈化萃取樣品，經(jīng)無水硫酸鈉脫水，于40℃水浴下真空濃縮至近干，定容1.0 mL，備用。

2 結果與討論

2.1 色譜柱的優(yōu)化

考察了不同極性的氣相色譜柱（非極性柱DB-5MS：30 m×0.250 mm×0.25 μm、強極性柱DB-WAX：30 m×0.250 mm×0.25 μm）對待測N-亞硝胺類物質的分離效果。結果表明：選用非極性柱時，色譜峰分離度也不好，N-二甲基亞硝胺的色譜峰與溶劑峰分不開；而選用強極性柱DB-WAX時，獲得的色譜峰峰形對稱、定量準確、重現(xiàn)性好、分離效果好。因此，本試驗選用DB-WAX作為色譜柱。

2.2 柱溫升溫速率的優(yōu)化

由于溶劑峰對對待測物質出峰的影響，因此需要優(yōu)化柱溫的升溫速率，以獲得最佳分離效果。選擇柱溫起始溫度為50℃，分別比較了升溫速率為15℃/min、10℃/min、5℃/min時分離效果，實驗結果顯示：當升溫速率為15℃/min時，溶劑峰與N-二甲基亞硝胺的色譜峰無法明確分出；當升溫速率為10℃/min時，能夠有效分離，而繼續(xù)降低升溫速率為5℃/min時，色譜峰的分離效果沒有明顯改善，因此選擇升溫速率為10℃/min。當柱溫升高到110℃時，N-二甲基亞硝胺的色譜峰已出峰，因此為了提高分析速度，將升溫速率提高為15℃/min。因此，最終選擇柱溫為：起始溫度50℃，保持3 min，以10℃/min升溫至110℃，之后以15℃/min升溫至200℃，再以40℃/min升溫至240℃。

按照上述優(yōu)化條件，選擇電子轟擊電離源（EI），電子能量為70 eV，采集模式為SIM，對3種N-亞硝胺混合標樣分析，得到標準品的保留時間和特征離子見表1，氣相色譜-質譜總離子流圖如圖1所示（濃度為200 ng/mL）。

圖1 3種N-亞硝胺標準品的氣相色譜-質譜總離子流圖（濃度為200 ng/mL）Fig.1 Total ion current chromatogram of three N-nitrosamines（c:200 ng/mL）

2.3 前處理條件的選擇

2.3.1 樣品提取方法的優(yōu)化

考察了分別選用水蒸氣蒸餾法和超聲振蕩提取法對樣品進行前處理，結果表明：超聲振蕩提取法獲取N-亞硝胺比水蒸氣蒸餾法提取更完全，且操作簡捷，因此，選擇超聲振蕩法提取樣品中的N-亞硝胺類物質。

2.3.2 固相萃取小柱的優(yōu)化

本實驗比較了5種固相萃取小柱凈化的效果。樣品加入適量N-亞硝胺混合標樣溶液，方法同1.2.4。通過比較每個萃取小柱所萃取的3種亞硝胺的回收率來確定最佳的萃取小柱，平行3次試驗，結果取平均值，作表2。由表2可以看出，選取活性炭固相萃取小柱效果較好，因此，本試驗采用活性炭萃取柱。

表2 5種固相萃取小柱萃取效果比較圖Tab.2 Comparison of clean-up effects of five SPE cartridges

2.4 工作曲線及檢測限

本方法采用外標法定量，配制5種N-亞硝胺的質量濃度為10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、1 000 ng/mL系列混合標準溶液，利用定量離子峰面積繪制標準曲線。每個質量濃度的樣品測定3次，以目標物的峰面積Y對其質量濃度X進行回歸分析，得到各N-亞硝胺的線性方程、相關系數(shù)和線性范圍見表2，3種化合物的選擇性離子色譜圖和掃描質譜圖如圖2～4所示。

表3 3種揮發(fā)性N-亞硝胺線性方程、相關系數(shù)、線性范圍及檢測限Tab.3 Regression equationgs,correlation coefficients,linear ranges and LOQs for three N-nitrosamines

圖2 NDMA選擇性離子色譜圖A和掃描質譜圖B（9.671 min）Fig.2 NDMA chromatogram(A)and mass spectrogram(B)of MIB(9.671 min)

圖3 NDBA選擇性離子色譜圖A和掃描質譜圖B（10.775 min）Fig.3 NDBA chromatogram(A)and mass spectrogram(B)of MIB(10.775 min)

圖4 NDPA選擇性離子色譜圖A和掃描質譜圖B（12.405 min）Fig.4 NDPA chromatogram(A)and mass spectrogram(B)of MIB(12.405 min)

由表3可知，本方法重現(xiàn)性好，線性范圍廣，相關系數(shù)可達0.999 5以上，檢測靈敏度高，檢測限：NDPA為1 ng/mL，NDMA、NDEA為2 ng/mL，達到ppb級。

2.5 回收率及精密度試驗

選擇腌制泥螺樣品進行加標回收試驗，加混合標樣200 ng/mL，各進行6次樣品測定，同時做空白樣試驗，檢測其本底成分，結果見表4。

表4 回收率及精密度（n=6）Tab.4 Precision and recovery for three N-nitrosamines（n=6）

由表4可知，本試驗采用的樣品處理方法，能夠達到國家標準規(guī)定的要求。

2.6 樣品測定分析

取3種比較常見的舟山腌制水產(chǎn)品樣品：鱈魚、鮟鱇魚、泥螺，分別編號：①、②、③，按1.2項試驗方法分別測定揮發(fā)性N-亞硝胺的含量，每個樣品平行3次，結果見表5，其中腌制泥螺的選擇離子色譜圖如圖5。

表5 實際樣品中3種揮發(fā)性N-亞硝胺含量測定Tab.5 Determination results of three N-nitrosamines in real samples

3 結論

本研究建立了一種適用于氣相色譜-質譜聯(lián)用法測定腌制水產(chǎn)品中3種N-亞硝胺的分析方法。比較了不同提取方法、不同固相萃取小柱、不同色譜柱對分離檢測的影響，結果表明：以二氯甲烷作為溶劑提取腌制水產(chǎn)品中的N-二甲基亞硝胺（NDMA）、N-二乙基亞硝胺（NDEA）、N-二丙基亞硝胺（NDPA）3種化合物，采用超聲振蕩法提取，選用活性炭萃取小柱，DB-WAX（30 m×0.250 mm×0.25 μm）色譜柱，分離效果良好。該方法前處理更簡單快速，且易于操作，重現(xiàn)性好，回收率可觀，在86%～99%之間，線性范圍10～1 000 ng/mL，方法靈敏度高，檢測限：NDPA為1 ng/mL，NDMA、NDEA為2 ng/mL，達到ppb級，并在實際樣品分析中應用良好，可適用于腌制水產(chǎn)品中N-亞硝胺物質含量的測定分析。

圖5 腌制泥螺的選擇離子色譜圖Fig.5 SIM chromatogram of salted snail

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