韓中保 李榮良 韓扣蘭

（鹽城衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，鹽城 224005）

間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）是屬于中胚層的一類多能干細(xì)胞，具有向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌細(xì)胞、肝臟細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞等多種細(xì)胞分化的能力，可來(lái)源于骨髓、臍帶、皮膚、肺臟等多處組織器官。骨髓MSC還參與構(gòu)成造血干細(xì)胞生存和分化的微環(huán)境，自體獲取的骨髓MSC 回輸后不發(fā)生免疫排斥反應(yīng)，體外基因轉(zhuǎn)染率高，但骨髓中MSC 的含量非常少。黃芪具有補(bǔ)氣固表，利尿托毒，排膿，斂瘡生肌的功效。黃芪多糖是黃芪主要成份之一，具有全方位的免疫調(diào)節(jié)和改善骨髓造血等作用。為了探討其對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的影響，我們通過(guò)體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)研究了黃芪多糖注射液對(duì)MSC增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及試劑

選取2月齡體重200～250g健康SD 大鼠30只，雌雄兼用（上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司）；淋巴細(xì)胞分離液（天津TDB 生物有限公司）；LDMEM、胰蛋白酶（美國(guó)GIBCO 公司）；活細(xì)胞計(jì)數(shù)（CCK－8）試劑盒（日本株式會(huì)社同仁化學(xué)研究所）；5－溴尿嘧啶核苷（Brdu）（Sigma公司）；黃芪多糖注射液（250mg／瓶，天津賽諾制藥有限公司）；生物素山羊抗大鼠IgG（博士德二抗試劑盒）；DAB 顯色劑（博士德生物工程有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 取2只SD 大鼠的股骨和脛骨，用DMEM 沖出骨髓。將沖出的骨髓和DMEM 混合液離心（1.5×103r／min）5min，去上清液后，用DMEM 制成懸液。用吸管沿管壁將懸液慢慢加入已裝有4ml分離液的離心管中，使兩種溶液間有明顯的界面，1.9×103r／min水平離心20min。用吸管小心吸取中層白色霧狀的細(xì)胞層，無(wú)血清DMEM 液洗滌兩次，然后用含15%小牛血清的DMEM 培養(yǎng)液重懸，5×105／ml接種，37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)。第5天，第1次換液，此后每7d換液兩次。

1.2.2 加藥培養(yǎng) 待細(xì)胞接近融合時(shí)，按1×104／ml傳代，傳至第3 代時(shí)，將細(xì)胞濃度調(diào)為2×105／ml，接種于96孔板（每孔100μl），培養(yǎng)24h；吸去上清液，每孔加不含血清的DMEM 溶液100μl，培養(yǎng)24h；吸去上清液，每孔加100μl含15%小牛血清的DMEM 培養(yǎng)液，同時(shí)加入黃芪多糖注射液（用生理鹽水稀釋為300、150、75、37.5、15mg／ml），每個(gè)濃度3個(gè)重復(fù)孔。3個(gè)陰性對(duì)照孔加等量的生理鹽水，培養(yǎng)48、72h，用CCK－8法檢測(cè)黃芪多糖注射液和生理鹽水對(duì)細(xì)胞的增殖作用。

1.2.3 CCK－8 法檢測(cè)MSC 增殖 細(xì)胞接種于96孔板上干預(yù)24h 后，每孔加入CCK－8 試劑10μl，繼續(xù)培養(yǎng)3h 后，在酶標(biāo)儀上讀取450nm 的吸光度，用吸光值A(chǔ) 表示。每組設(shè)3 個(gè)重復(fù)孔，另設(shè)空白孔調(diào)零［1］。

1.2.4 Brdu表達(dá)的檢測(cè) 將28只大鼠隨機(jī)均分為黃芪多糖注射液組和生理鹽水組。黃芪多糖組每只肌注黃芪多糖注射液0.2 ml（含黃芪多糖25 mg）；陰性對(duì)照組每只注射等量生理鹽水0.2 ml，qd，連續(xù)5d。在連續(xù)注射的第3、4天，每只腹腔注射1ml Brdu（10mg／ml）。停藥后第1天開(kāi)始每組每天隨機(jī)取大鼠2 只，連續(xù)5d，進(jìn)行MSC 原代培養(yǎng)。每組MSC培養(yǎng)至第2代時(shí)，制成2×105／ml細(xì)胞懸液，滴于涂有多聚賴氨酸的蓋玻片上，制成爬片，每組3張。余下大鼠（每組4只）繼續(xù)喂養(yǎng)，觀察其注射黃芪多糖注射液和生理鹽水后MSC 的活力。從Brdu免疫組化的細(xì)胞爬片上可以觀察到兩組均有Brdu陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 黃芪多糖注射液對(duì)MSC增殖的影響

300、150、75、37.5mg／ml濃度黃芪多糖組的吸光值與生理鹽水組比較有顯著差異（P＜0.05），且呈劑量依賴關(guān)系，而15 mg／ml濃度黃芪多糖組的吸光值與生理鹽水組比較未見(jiàn)明顯差異（P＞0.05）。不同藥物濃度、24與48小時(shí)之間的吸光度也存在一定差異，但不顯著（見(jiàn)表1）。

表1 不同組別間吸光度值比較（）Table 1 Compare of absorbance in different groups（）

表1 不同組別間吸光度值比較（）Table 1 Compare of absorbance in different groups（）

注：與生理鹽水組比較，＊P＜0.05

2.2 黃芪多糖注射液對(duì)MSC Brdu標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的影響

Brdu標(biāo)記陽(yáng)性率在用藥后逐漸升高，5天達(dá)到峰值，后漸下降（見(jiàn)表2），用藥后2～5 天黃芪多糖組與生理鹽水組比較有顯著性差異（P＜0.05）。

表2 MSC Brdu標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（）Table 2 Compare of Brdu－positive MSC in different groups（）

表2 MSC Brdu標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（）Table 2 Compare of Brdu－positive MSC in different groups（）

注：與生理鹽水組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

3 討論

MSC治療是通過(guò)移植自體、異體MSC 進(jìn)入宿主體內(nèi)，以補(bǔ)充、替代或糾正某些組織細(xì)胞的數(shù)量或質(zhì)量異常的技術(shù)手段。MSC 因?yàn)轶w外易擴(kuò)增與純化，移植到體內(nèi)免疫原性低，目前已成臨床治療研究的熱點(diǎn)。許多動(dòng)物與臨床研究均證實(shí)MSC 移植治療安全有效，但如何進(jìn)一步提高移植效果是目前亟待解決的課題。

黃芪多糖對(duì)許多細(xì)胞的增殖、分化及分泌有影響。黃芪多糖能提高樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）表面分子CD40、CD80、HLA－DR 的表達(dá)，經(jīng)黃芪多糖誘導(dǎo)的DC活化的細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞（CIK），對(duì)A549肺腺癌細(xì)胞的殺傷活性高于單純DC－CIK 細(xì)胞［2］。黃芪多糖通過(guò)降低人心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞表面細(xì)胞間黏附分子1蛋白表達(dá)，進(jìn)而抑制與外周血中性粒細(xì)胞的黏附，從而對(duì)缺血再灌注損傷人心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞具有 保護(hù)作 用［3］。大量 研究［4－6］顯示 注射黃芪多糖能使正常及化療小鼠骨髓、脾及外周血中的造血干細(xì)胞有不同程度的增加，能刺激人外周血單核細(xì)胞產(chǎn)生G－CSF 和GM－CSF 造血細(xì)胞因子，且呈明顯的量效關(guān)系和時(shí)效關(guān)系。我們將5個(gè)不同濃度的黃芪多糖注射液直接加入大鼠骨髓MSC 培養(yǎng)液中，作用24、48h，用CCK－8法觀察發(fā)現(xiàn)，300、150、75、37.5mg／ml 4個(gè)濃度對(duì)MSC 具有顯著的增殖效應(yīng)。SD 大鼠肌肉注射黃芪多糖，用Brdu標(biāo)記增殖MSC，免疫組化方法顯示，用藥后，黃芪多糖組MSC增殖能力明顯增強(qiáng)，在給藥后2d 就開(kāi)始增殖，明顯前移，5d達(dá)最高，到第9天仍然比生理鹽水組高。因此，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)黃芪多糖注射液對(duì)骨髓MSC 具有顯著的促增殖作用，能促進(jìn)MSC 的生長(zhǎng)，且呈劑量依賴性。黃進(jìn)等［7］研究表明：APS含藥血清可能主要促進(jìn)MSCs 可溶性SCF 蛋白的表達(dá)，細(xì)胞外液中增多的SCF 進(jìn)一步通過(guò)旁分泌作用促進(jìn)了MSCs的增殖。當(dāng)然對(duì)MSC 分化及細(xì)胞因子分泌的影響還有待進(jìn)一步研究。

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［2］張嵩，牟曉燕，王紅梅，等.黃芪多糖誘導(dǎo)的樹(shù)突狀細(xì)胞增強(qiáng)CIK細(xì)胞的殺傷作用［J］.中國(guó)免疫學(xué)雜志，2009，25（2）：140－142.

［3］陳立新，朱海燕，朱陵群，等.黃芪多糖對(duì)人心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及再灌注后內(nèi)皮細(xì)胞與中性粒細(xì)胞黏附的影響［J］.中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2007，11（27）：5382－5386.

［4］夏星，申萍，嚴(yán)翠娥，等.黃芪多糖在長(zhǎng)期骨髓細(xì)胞培養(yǎng)中支持體外造血的作用［J］.中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2003，10（4）：27－28.

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［7］黃進(jìn)，張進(jìn)，徐志偉.黃芪多糖對(duì)體外培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和干細(xì)胞因子表達(dá)的刺激作用［J］.復(fù)旦學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2011，38（4）：343－348.