閻斌倫, 張曉君, 秦國(guó)民, 畢可然, 徐 靜, 秦 蕾

(淮海工學(xué)院 江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 江蘇 連云港 222005)

4種病原弧菌外膜蛋白的提取及抗原性初步分析

閻斌倫, 張曉君, 秦國(guó)民, 畢可然, 徐 靜, 秦 蕾

(淮海工學(xué)院 江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 江蘇 連云港 222005)

利用十二烷基磺酸鈉抽提并結(jié)合超速離心的方法提取了鰻弧菌(Vibrio anguillarum)、河口弧菌(V.aestuarianus)、霍亂弧菌(V.cholerae)和副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)4種致病性弧菌的主要外膜蛋白, 通過(guò)SDS-PAGE分析比較4種弧菌主要外膜蛋白的組分。結(jié)果表明： 4株弧菌的外膜蛋白電泳圖譜一般可得到5～10條蛋白帶, 分子量多數(shù)集中在26～40 kD和48～85 kD。對(duì)所提取的4種弧菌主要外膜蛋白進(jìn)行SDS-PAGE后, 分別與自制的兔抗鰻弧菌血清、抗河口弧菌血清、抗副溶血弧菌血清進(jìn)行Western-blotting印跡分析。結(jié)果顯示每種全菌抗血清可與相應(yīng)菌的外膜蛋白部分組分發(fā)生免疫反應(yīng),并與其他3種弧菌外膜蛋白的部分組分產(chǎn)生交叉免疫反應(yīng), 這些反應(yīng)條帶分子量主要集中于30～48 kD之間。本研究為進(jìn)一步研究致病性弧菌外膜蛋白免疫學(xué)特性提供參考。

鰻弧菌(Vibrio anguillarum); 河口弧菌(V.aestuarianus); 霍亂弧菌(V.cholerae); 副溶血弧菌(V.parahaemolyticus); 外膜蛋白; Western-blotting印跡

由弧菌屬(Vibrio)細(xì)菌引起的“弧菌病(Vibriosis)”是在世界各地海、淡水養(yǎng)殖魚(yú), 蝦, 蟹,貝類(lèi)等水產(chǎn)動(dòng)物中普遍流行且危害最大的細(xì)菌性疾病, 給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失。因此, 弧菌病的有效預(yù)防與控制已成為目前水產(chǎn)動(dòng)物的健康養(yǎng)殖和可持續(xù)發(fā)展的重要保障。外膜蛋白(Outer Membrane Protein, OMP)位于革蘭氏陰性菌表面, 產(chǎn)量豐富, 具有良好的免疫原性, 不僅可激發(fā)機(jī)體的體液免疫, 而且還可引起細(xì)胞免疫并可與其他相關(guān)病原菌及同種不同血清型菌株產(chǎn)生免疫交叉反應(yīng),可認(rèn)為是一種潛在的共同免疫保護(hù)性抗原。因此主要外膜蛋白是病原細(xì)菌疫苗的重要材料, 是制備免疫保護(hù)特異性強(qiáng)的亞單位疫苗的候選成分, 分離出參與血清學(xué)反應(yīng)的主要外膜蛋白并制備相應(yīng)免疫制劑, 將能有效保證其相應(yīng)的免疫保護(hù)效果, 近年來(lái)的研究也證實(shí)了病原細(xì)菌外膜蛋白在作為保護(hù)性抗原方面的作用。

幾年來(lái), 作者在對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物細(xì)菌性疾病及相應(yīng)病原細(xì)菌的研究中, 分離到具有強(qiáng)致病性的鰻弧菌(V.anguillarum)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、霍亂弧菌(V.cholerae)及河口弧菌(V.aestuarianus)[1-4]。本研究以此 4種病原弧菌為研究材料, 提取并比較了4種病原弧菌外膜蛋白成分, 并通過(guò)Western-blot初步分析了 4種病原弧菌外膜蛋白的抗原性。本研究旨在探索 4種病原弧菌外膜蛋白組分及抗原性,為致病性弧菌免疫學(xué)研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 供試菌株

供試鰻弧菌(BH1株)及河口弧菌(TS1株)分離自江蘇省贛榆縣某工廠化養(yǎng)殖病(死)半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis L.); 副溶血弧菌(JGB080708-1株)分離自江蘇省贛榆縣池塘養(yǎng)殖發(fā)病凡納濱對(duì)蝦幼蝦(Litopenaeus vannamei L.); 霍亂弧菌(LD081008B-1株)分離自江蘇省贛榆縣池塘養(yǎng)殖發(fā)病泥鰍(Misgurnus anguillicaudatus L.), 均為本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存。

1.2 免疫血清的制備

1.2.1 菌體抗原的制備

4株供試菌接種于普通營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基, 置 28℃培養(yǎng)18 h后, 加入福爾馬林溶液0.5 mL(0.5%)后于37 ℃作用24 h滅活(菌檢合格供用), 以6 000 r/min離心15 min后棄上清, 沉淀菌體經(jīng)無(wú)菌生理鹽水洗滌3次后, 再用無(wú)菌生理鹽水16 mL懸浮即為全菌(OK)免疫原。

1.2.2 免疫血清的制備

取上述OK免疫原, 經(jīng)耳靜脈注射接種體質(zhì)量2 kg左右的健康家兔。接種前取家兔血少許分離血清后, 以上述菌株為抗原, 對(duì)所用家兔進(jìn)行相應(yīng)的血清玻片凝集試驗(yàn), 陰性的用于免疫接種。免疫劑量為2.0 mL/次, 間隔6 d免疫1次, 共4次, 末次后的7 d耳靜脈采血少許分離血清測(cè)定其凝集效價(jià), 合格后心臟采血分離血清, 置-20℃凍結(jié)保存供用。

1.3 外膜蛋白的提取

分別將4種弧菌接種于150 mL的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中, 28℃過(guò)夜培養(yǎng) 18 h后低速離心細(xì)菌培養(yǎng)物(4℃、4 000 r/min、30min), 收集菌體; 用20 mmol/L Tris-HCl (pH 7.4, 含10 mmol/L EDTA) 緩沖液洗滌3次后, 溶于適量緩沖液中, 置冰浴中超聲波破碎細(xì)胞 10 min(振幅50%); 以4℃、6 000 r/min離心30 min,收集上清液; 經(jīng)4℃、15 000 r/min離心1 h, 棄上清;沉淀溶于含0.5%(w/v)SDS的上述緩沖液中, 置37℃作用30 min后, 以4℃、15 000 r/min離心1 h, 棄上清; 然后用20 mmol/L Tris-HCl緩沖液洗滌沉淀1～2次, 溶于雙蒸水, 置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 外膜蛋白SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)

采用解離非連續(xù)緩沖系統(tǒng)垂直板電泳。將所提取的外膜蛋白與電泳上樣緩沖液(0.5 mol/L Tris-HCl;pH=6.8; 10% SDS; 1% β-巰基乙醇; 10%甘油; 0.05%溴酚藍(lán))按照4：1體積混勻, 加熱煮沸5 min, 冷卻后低速離心 1 min, 用微量加樣器加樣, 每孔加入 15 μL樣品。采用 Tris-甘氨酸(Gly)電泳緩沖液(0.025 mol/L Tris-Base; 0.25 mol/L甘氨酸; 0.1% SDS; pH 8.3), 4℃條件下電泳。丙烯酰胺濃度： 分離膠10%(v/v), 濃縮膠 4.75%(v/v)。濃縮膠部分恒定電流為40 mA, 分離膠部分恒定電流為60 mA。電泳結(jié)束后, 取出凝膠經(jīng)考馬斯亮藍(lán)R250(Sigma)染色后用全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)掃描, Gel-Pro Analyzer軟件分析各蛋白的分子量。

1.5 Western-blotting印跡試驗(yàn)

SDS-PAGE結(jié)束后, 利用半干法對(duì)膜蛋白進(jìn)行轉(zhuǎn)印, 即將凝膠均勻轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素(NC)膜上, 40 mA轉(zhuǎn)移1 h。含有5%牛血清白蛋白(BSA)的PBS緩沖液4 ℃封閉過(guò)夜, PBST (含有0.05 % Tween20的PBS) 洗滌 3次, 每次5 min。然后分別將不同的膜浸在稀釋50倍的兔抗鰻弧菌、河口弧菌、副溶血弧菌全菌血清中37 ℃溫育1 h。PBST洗膜3次, 每次5 min。于堿性磷酸酶(AP)標(biāo)記的羊抗兔IgG(1：1000,Sigma)中37 ℃溫育1 h。PBST洗膜3次, 每次5 min。最后將膜用含有66 μL NBT貯液(0.5 g NBT溶于10 mL70%的二甲基亞砜中)和 33 μL BCIP貯液(0.5 g BCIP溶于10 mL 100%二甲基亞砜中)的NBT/BCIP 緩沖液(10 mL)中發(fā)色 15～20 min, 雙蒸水水洗終止反應(yīng)、晾干。

2 結(jié)果

2.1 SDS-PAGE圖譜

鰻弧菌、河口弧菌、副溶血弧菌和霍亂弧菌由SDS法制備的外膜蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳顯示如圖1。副溶血弧菌主要有 5條蛋白帶, 分子量大約在28～65 kD, 其中分子量大約在 29 kD的條帶產(chǎn)物量較多; 鰻弧菌主要有 5條蛋白帶, 分子量在 40～26 kD, 其中分子量大約在 28 kD的條帶產(chǎn)物量較多;河口弧菌主要有 8條蛋白帶, 分子量大約在 24～65 kD, 其中分子量大約在24 kD和26 kD的條帶產(chǎn)物量較多; 霍亂弧菌主要有 10條蛋白帶, 分子量大約在19～60 kD, 其中分子量大約在30 kD的條帶產(chǎn)物量較多。電泳結(jié)果顯示, 鰻弧菌、河口弧菌、副溶血弧菌和霍亂弧菌外膜蛋白組分不同, 但每種弧菌都具有一條產(chǎn)物量較多的條帶, 鰻弧菌大約在 28 kD,河口弧菌大約在 26 kD, 副溶血弧菌大約在 30 kD,霍亂弧菌大約在32 kD。

圖1 4種病原弧菌外膜蛋白的SDS-PAGE圖譜Fig. 1 SDS-PAGE profiles of outer membrane proteins of 4 pathogenic Vibrio sp.1. 副溶血弧菌; 2. 鰻弧菌; 3. 河口弧菌; 4. 霍亂弧菌; M.Marker(下同)1. V.anguillarum; 2. V.aestuarianus; 3. V.cholerae; 4. V.parahaemolyticus; M.Marker

2.2 Western-blotting結(jié)果

兔抗鰻弧菌、抗副溶血弧菌、抗河口弧菌血清與各外膜蛋白的 Western-blotting印跡表明, 兔抗鰻弧菌血清與霍亂弧菌和鰻弧菌菌株自身有1條免疫反應(yīng)帶,與副溶血弧菌有 1條免疫反應(yīng)帶, 而與河口弧菌沒(méi)有出現(xiàn)免疫反應(yīng)帶(圖 2); 兔抗河口弧菌血清與鰻弧菌出現(xiàn)3條免疫反應(yīng)條帶, 與河口弧菌自身菌株出現(xiàn)2條免疫反應(yīng)條帶, 與霍亂弧菌出現(xiàn)1條免疫反應(yīng)條帶, 與副溶血弧菌則無(wú)免疫反應(yīng)條帶出現(xiàn)(圖3); 兔抗副溶血弧菌血清與鰻弧菌菌株出現(xiàn) 5條免疫反應(yīng)條帶, 與河口弧菌出現(xiàn) 4條主要的免疫反應(yīng)帶, 與副溶血弧菌自身菌株出現(xiàn)1條免疫反應(yīng)條帶(圖4)。

圖2 兔抗鰻弧菌血清作為一抗的免疫圖譜Fig. 2 Western-blot profile with rabbit serum against V.anguillarum as the first antibody

圖3 兔抗河口弧菌血清作為一抗的免疫圖譜Fig. 3 Western-blot profile with rabbit serum against V.aestuarianus as the first antibody

圖4 兔抗副溶血弧菌血清作為一抗的免疫圖譜Fig. 4 Western-blot profile with rabbit serum against V.parahaemolyticus as the first antibody

3 討論

國(guó)內(nèi)外在魚(yú)類(lèi)病原弧菌的外膜蛋白的免疫性狀研究方面已多有報(bào)道, 吳灶和等[5]報(bào)道溶藻弧菌外膜蛋白對(duì)凡納濱對(duì)蝦具有較好的免疫原性; 黃志堅(jiān)等[6]及段翠蘭等[7]報(bào)道溶藻酸弧菌的主要外膜蛋白的免疫原性很強(qiáng), 是重要的保護(hù)性抗原; 毛芝娟等[8]從浙江省象山港網(wǎng)箱養(yǎng)殖大黃魚(yú)分離的一株副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)中克隆了兩種鐵調(diào)外膜蛋白psuA和pvuA的基因, 獲得大量表達(dá)后免疫大黃魚(yú), 結(jié)果顯示該兩種鐵調(diào)外膜蛋白具有良好的免疫原性, 有可能作為高效疫苗成分。張崇文等[9]從哈維氏弧菌的總 DNA 中成功克隆了外膜蛋白 OmpK基因并在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá), 用純化的融合重組蛋白免疫新西蘭白兔獲得了高效價(jià)的抗血清,免疫印跡顯示抗血清和哈氏弧菌外膜蛋白中分子質(zhì)量約為 27 kD 的蛋白產(chǎn)生了一條特異反應(yīng)帶, 提示哈氏弧菌外膜蛋白 OmpK是它的保護(hù)性抗原之一,有望作為其疫苗的有效成分在大黃魚(yú)哈氏弧菌病的防治中發(fā)揮作用。周麗等[10]分離鰻弧菌和溶藻膠弧菌(V.alginolyticus)的外膜蛋白并通過(guò)免疫印跡對(duì)其特性進(jìn)行分析, 發(fā)現(xiàn)分子量大小為 51 kD的外膜蛋白可能是鰻弧菌和溶藻膠弧菌共有的抗原; Chart等[11]從鰻弧菌分離的 2個(gè)小分子量的外膜蛋白能有效的刺激機(jī)體的免疫反應(yīng), 說(shuō)明外膜蛋白也是鰻弧菌很好的保護(hù)性抗原; 董傳甫等[12]發(fā)現(xiàn)分子量為36 kD的主要外膜蛋白是副溶血弧菌和溶藻弧菌具有強(qiáng)免疫性的主要抗原。

外膜蛋白是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的特有成分, 位于細(xì)菌的表層, 在維持外膜結(jié)構(gòu), 物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)方面發(fā)揮著重要作用, 具有直接與機(jī)體免疫系統(tǒng)接觸的機(jī)會(huì)。本研究表明鰻弧菌、河口弧菌、副溶血弧菌和霍亂弧菌具有不同的外膜蛋白組分, 但每種弧菌都具有一條產(chǎn)物量較多的條帶, 有望作為同種不同血清型菌株間的共同免疫保護(hù)抗原; Western-blotting印跡分析表明, 每種供試菌的全菌抗血清可與自身的外膜蛋白部分組分發(fā)生免疫反應(yīng), 并與其他 3種弧菌外膜蛋白的部分組分產(chǎn)生交叉免疫反應(yīng)。該研究結(jié)果可為弧菌免疫學(xué)深入研究提供參考。

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Isolation and antigenicity analysis of outer membrane proteins from 4 pathogenic Vibrio sp.

YAN Bin-lun, ZHANG Xiao-jun, QIN Guo-min, BI Ke-ran, XU Jing, QIN Lei
(Jiangsu Key Laboratory of Marine Biotechnology, Huaihai Institute of Technology, Lianyungang 222005, China)

Jul., 4, 2011

Vibrio anguillarum; Vibrio aestuarianus; Vibrio cholerae; Vibrio parahaemolyticus; outer membrane protein;Western-blotting

The outer membrane proteins of 4 pathogenic Vibrio sp. (V.anguillarum, V.aestuarianus, V.cholerae and V.parahaemolyticus) were extracted using sodium laurylsulfonate and ultracentrifuging methods, and the ingredient of the outer membrane proteins were analyzed using SDS-PAGE. The SDS-PAGE results showed that five to ten proteins bands could be obtained for each vibrio with molecular weights ranging from 26 to 40 kD and from 48 to 85 kD. Western-blotting analysis was conducted after SDS-PAGE, the results showed that some of the outer membrane protein bands have cell antigenicity in the Western-blotting with rabbit antiserum against whole cell of V.anguillarum, V.aestuarianus,V.cholerae and V.parahaemolyticus, respectively, the molecular weights were between 30 to 48 kD. This study can provide reference for immunologic research of outer membrane proteins of pathogenic Vibrios.

S94

A

1000-3096(2012)05-0071-04

2011-07-04;

2011-09-01

江蘇省六大人才高峰項(xiàng)目(2009); 連云港市科技攻關(guān)資助項(xiàng)目(CG0907); 江蘇省水產(chǎn)三項(xiàng)工程資助項(xiàng)目(P2009-18)

閻斌倫(1962-)男, 江蘇贛榆人, 教授, 主要從事應(yīng)用海洋生物技術(shù)與水產(chǎn)健康養(yǎng)殖研究, E-mail：yanbinlun@yahoo.com.cn

(本文編輯：譚雪靜)