徐學(xué)鋒，姬宏超，李巧玲，莫美華

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州 510642)

草菇有性世代間rDNA序列變異分析及RAPD分析

徐學(xué)鋒，姬宏超，李巧玲，莫美華

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州 510642)

草菇的遺傳與有性生殖過(guò)程存在很多的特殊性和不確定性，本研究以草菇V23菌株的成熟子實(shí)體彈射孢子，單孢分離后得13個(gè)單株，分別搖瓶培養(yǎng)、收集菌絲，提取總DNA，用通用引物ITS4、ITS5進(jìn)行PCR擴(kuò)增后連接、轉(zhuǎn)化并測(cè)序，將單孢間和單孢與親本間的ITS序列進(jìn)行比對(duì)，分析草菇ITS序列多樣性及變異性;同時(shí)以相應(yīng)單孢菌株DNA為模板，用20條隨機(jī)引物進(jìn)行RAPD擴(kuò)增。結(jié)果表明:草菇單孢間和單孢與親本間的ITS序列相似度均在99%以上，相較于親本的ITS序列，單孢序列中發(fā)現(xiàn)了有5個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)堿基轉(zhuǎn)換，但沒(méi)有兩個(gè)以上的單孢發(fā)生同一轉(zhuǎn)換;20條隨機(jī)引物分別與14個(gè)樣本進(jìn)行RAPD擴(kuò)增，其中3個(gè)引物出現(xiàn)多態(tài)性條帶，帶型結(jié)果發(fā)現(xiàn)單孢菌株間的帶型差異呈現(xiàn)一定規(guī)律。草菇ITS序列變異較少，不適于單孢間的變異分析，而RAPD方法對(duì)摸索草菇有性世代間的遺傳分離規(guī)律有重要價(jià)值。

草菇，ITS，RAPD，同宗結(jié)合

草菇(Volariella volvacea(Bull.ex.Fr.)Sing.)，是一種喜溫、喜濕的草腐型食用真菌，又名苞腳菇、廣東菇等，是我國(guó)南方食用菌栽培的主要品種之一。草菇的性模式十分復(fù)雜，其子實(shí)體產(chǎn)生的有性單孢子可以不與其它孢子融合而產(chǎn)生新的子實(shí)體。Chang等人［1－3］通過(guò)研究草菇抗性突變體、營(yíng)養(yǎng)缺陷型等的分離規(guī)律，初步認(rèn)為草菇是初級(jí)同宗結(jié)合菌。然而，早在1971年，S T Chang和C K Yau［4－5］發(fā)現(xiàn)在草菇的單孢子分離物中存在大量變異，這對(duì)已有的草菇遺傳模式的解釋提出了質(zhì)疑，且到目前為止仍未得到充分解釋。究其原因，主要是因?yàn)檎婢煌诟叩葎?dòng)植物，其自身的表觀遺傳特征不明顯，可以用于遺傳分析的性狀更少，雖然抗性突變體、營(yíng)養(yǎng)缺陷型等常規(guī)手段有一定意義，但終因獲取困難、不夠穩(wěn)定等原因，無(wú)法系統(tǒng)廣泛地應(yīng)用到草菇的性模式研究中。在基因組分子層面，核糖體DNA中的內(nèi)轉(zhuǎn)錄區(qū)間(internal transcribed sequence，ITS)序列是兩個(gè)中度保守的區(qū)域，其進(jìn)化速度較核糖體序列快，故而在一些物種的種內(nèi)都存在明顯差異，常用于真菌的遺傳多樣性及分子進(jìn)化研究［6－9］。RAPD(random amplified polymorphic DNA)分析則已是一項(xiàng)非常成熟的分子技術(shù)手段，其核心是利用隨機(jī)引物的PCR擴(kuò)增，將基因組中無(wú)序、模糊的多態(tài)信息變成條理化、可以清晰比較的統(tǒng)計(jì)信息，從宏觀上評(píng)估生物的遺產(chǎn)差異，常用于遺傳多樣性分析及分子輔助鑒定等等［10－12］。本研究擬測(cè)定草菇有性單孢分離株的ITS序列，比較親子代菌株間的ITS序列差異，同時(shí)，對(duì)相應(yīng)的菌株基因組進(jìn)行RAPD分析，希望發(fā)現(xiàn)rDNA序列的變異規(guī)律及RAPD數(shù)據(jù)的分離規(guī)律，嘗試在分子層面為揭示草菇有性遺傳規(guī)律打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

草菇菌株 常規(guī)栽培品種V23，由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院保藏;Taq酶、大腸桿菌DH5a、PMD－18－T載體、RNA酶等 購(gòu)自Takara公司;引物 由上海捷瑞生物有限公司合成。

Eppendorf 5415D離心機(jī)，PCR儀，UVP凝膠成像系統(tǒng)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 單孢菌株分離及菌絲培養(yǎng) 取成熟子實(shí)體一只，收集有性孢子，在無(wú)菌條件下，利用無(wú)菌水將孢子進(jìn)行梯度稀釋，經(jīng)鏡檢選擇合適濃度涂PDA平板，置于35℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)孢子萌發(fā)立即挑出，置于新的PDA斜面培養(yǎng)保種。挑取斜面菌種接種于含PDA液體培養(yǎng)基的三角瓶中，35℃搖瓶培養(yǎng)5～7d，收集菌絲備用。

1.2.2 ITS片段的克隆與測(cè)序 取0.2g菌絲，置于液氮中碾磨，經(jīng)SDS破壁、酚/氯仿抽提，用95%乙醇沉淀得基因組DNA，70%乙醇洗滌后溶于無(wú)菌水，檢測(cè)質(zhì)量后備用，詳細(xì)步驟參見(jiàn)文獻(xiàn)［11］。由公司合成通用引物ITS4和ITS5(見(jiàn)表1)后，以基因組DNA為模板，采用常規(guī)PCR程序進(jìn)行ITS克隆，電泳檢測(cè)后，以試劑盒回收目的片段，連接T－載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，檢測(cè)得陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，送公司測(cè)序。

表1 引物編號(hào)及其序列Table 1 Noumbers and sequence of primer

1.2.3 RAPD分析 以基因組DNA為模板，隨機(jī)引物見(jiàn)表1，PCR擴(kuò)增程序:94℃預(yù)變性3min，94℃變性40s，40℃退火1min，72℃延伸1min，共30個(gè)循環(huán)，最后延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，照相后進(jìn)行多態(tài)性分析。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 ITS序列通過(guò)blast比對(duì)確認(rèn)序列屬性，經(jīng)clustalX比對(duì)后分析不同序列間的差異;將RAPD圖譜的帶型轉(zhuǎn)換成數(shù)據(jù)矩陣，采用Phylip3.6軟件計(jì)算相似系數(shù)，得到相似系數(shù)矩陣，采用平均連鎖聚類分析方法(Un weighted Pair Group Method with Arithmetic Clustering，UPGMA)進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建樹(shù)狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 ITS序列分析

基因組DNA經(jīng)測(cè)定OD260/280值在1.8～2.0之間，電泳檢測(cè)條帶整齊。以此為模板進(jìn)行ITS序列片段的PCR擴(kuò)增，得750bp左右的條帶(見(jiàn)圖2)，測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖3，與Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知序列進(jìn)行比較，與已登記的草菇ITS序列的相似性為99.8%，擴(kuò)增所得序列確定為草菇V23的ITS片段。親本與單孢子之間，單孢子與單孢子之間的 ITS序列用clustalx1.81軟件進(jìn)行完全比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)親本與單孢子之間、單孢子與單孢子之間序列的相似程度很高，均在99%以上，其中單孢子分離株V1、V2、V7、V11、V12變異均是一個(gè)堿基的轉(zhuǎn)換，沒(méi)有發(fā)生堿基的插入或缺失，與親代菌株比較，單孢子V1在129bp處發(fā)生了C—T轉(zhuǎn)換，單孢子V7和V12分別在586bp和640bp處發(fā)現(xiàn)了G—A轉(zhuǎn)換，單孢子V2和V11分別在471bp和284bp處發(fā)現(xiàn)T—C轉(zhuǎn)換(見(jiàn)圖3)。變異的位點(diǎn)較少，突變方向具有隨機(jī)性，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)兩個(gè)或兩個(gè)以上的序列發(fā)生相同的變異位點(diǎn)。

圖1 草菇基因組DNAFig.1 Genomic DNA of Volariella volvacea

圖2 ITS序列的PCR產(chǎn)物Fig.2 PCR fragments of ITS

2.2 RAPD分析

20條隨機(jī)引物分別與14個(gè)樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中S47、S48、S32出現(xiàn)多態(tài)性條帶(圖4)。由圖中可以看到同一引物對(duì)不同菌株進(jìn)行擴(kuò)增所產(chǎn)生的DNA片段數(shù)目、分子量大小均不相同，其中S47與14個(gè)樣品擴(kuò)增所得電泳條帶都表現(xiàn)較少，S48、S32條帶數(shù)較多，最多達(dá)9條，最少0條。

表2 單孢子之間及與親本之間的遺傳相似系數(shù)矩陣Table 2 Genetic similarity matrix of parental isolate and single spore isolates

圖3 13個(gè)單孢子菌株與親本菌株V23ITS序列多態(tài)性的比較Fig.3 ITS nucleotide polymorphism between parental isolates V23and 13 single spore strains

圖4 引物S47(a)、S48(b)、S32(c)的RAPD電泳圖譜Fig.4 Electrophorogram of RAPD analysis with random primers S47(a)，S48(b)and S32(c)

將PCR多態(tài)性條帶進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，采用Phylip3.6軟件計(jì)算相似系數(shù)，得到相似系數(shù)矩陣(表2)，用Ntsys2.10e軟件建立系統(tǒng)樹(shù)狀圖(圖5)。從系統(tǒng)聚類分析生成的樹(shù)狀圖譜中可以看出，當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.53時(shí)，所有單孢子與親本V23被聚類為一大類;當(dāng)遺傳相似系數(shù)升至0.612時(shí)，這14個(gè)菌株被分為3類。其中單孢子V1、V2、V3、V4為第一大類;V7、V8、V9、V10為第二大類;V5、V6、V11、V12、V13、V23為第三大類。隨著相似系數(shù)的增加聚類越多;當(dāng)相似系數(shù)達(dá)到0.88時(shí)，所有單孢子與親本菌株可分為9大類。只有V11、V12與親本菌株的親緣關(guān)系最近;V7、V8與親本的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。通過(guò)遺傳相似系數(shù)可以看出來(lái)草菇單孢子之間、單孢子與親本之間在基因組多態(tài)性上存在很大的差異。

圖5 草菇單孢子菌株及親本V親的遺傳相似系數(shù)聚類圖Fig.5 Cluster dendrogram of parental isolate and single spore isolates

3 討論

核糖體DNA(rDNA)中的ITS1和ITS2是兩個(gè)中度保守區(qū)域，其保守性基本上表現(xiàn)為種內(nèi)相對(duì)一致，種間差異比較明顯。這種特點(diǎn)使ITS適合于物種的分子鑒定以及屬內(nèi)物種間或種內(nèi)差異較明顯的菌群間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究。ITS序列片段較小，易于分析，目前已被廣泛應(yīng)用于真菌屬內(nèi)不同種間或近似屬間的系統(tǒng)發(fā)育研究中。王德信［7］利用ITS序列分析對(duì)3種天麻不同變異類型的親緣關(guān)系做出了鑒定;徐學(xué)鋒等［6，8－9］應(yīng)用ITS序列研究了我國(guó)及亞洲地區(qū)lentinula屬內(nèi)及種間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。本研究比較了草菇親子代菌株間的ITS序列間的差異，結(jié)果顯示單孢菌株間、單孢與親本菌株間的ITS序列的差異較小，說(shuō)明草菇ITS序列的保守性較好，不適合用于比較單孢菌株間的差異以探討草菇的性模式，應(yīng)該尋求變異度較高的基因作為研究對(duì)象加以分析。

RAPD技術(shù)由于具有操作簡(jiǎn)單、分析速度快、成本較低、安全等優(yōu)點(diǎn)，得到了廣泛應(yīng)用。陳劍［10］等利用RAPD技術(shù)鑒定了草菇雜交后代;傅俊生［11］等利用RAPD標(biāo)記和SRAP標(biāo)記對(duì)草菇雜交菌株2628做了鑒定和品比實(shí)驗(yàn);余志晟［12］等利用RAPD對(duì)草菇栽培菌株DNA多態(tài)性進(jìn)行了分析。本研究利用RAPD對(duì)草菇單孢子和親本進(jìn)行分析，不同引物的擴(kuò)增效果有差異，20條隨機(jī)引物進(jìn)行擴(kuò)增，只有S47、S48及S32出現(xiàn)了多態(tài)性條帶;S47出現(xiàn)條帶相對(duì)較少，引物S48和S32形成的RAPD條帶較為清楚，效果較好，但總體數(shù)據(jù)略顯不足。聚類分析的結(jié)果提示我們，RAPD技術(shù)可以應(yīng)用于探索草菇有性生殖過(guò)程中的遺傳分離規(guī)律。

對(duì)草菇性模式的探討已有多年的歷史，現(xiàn)在學(xué)術(shù)界基本傾向于草菇是一種初級(jí)同宗結(jié)合菌，但是草菇的有性遺傳現(xiàn)象的表現(xiàn)不一致，存在不確定性。同宗結(jié)合是一個(gè)復(fù)雜的遺傳過(guò)程，是部分細(xì)胞核發(fā)生變異后才發(fā)生遺傳重組，還是同質(zhì)細(xì)胞核間發(fā)生重組，這種重組是如何發(fā)生的等問(wèn)題仍然沒(méi)有得到合理解釋，因此，基于染色體行為的研究必須應(yīng)用大量的分子標(biāo)記、DNA序列分析等新的方法才能打開(kāi)新的局面。

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Sequence variation of rDNA and RAPD analysis between sexual generations of Volariella volvacea

XU Xue－feng，JI Hong－chao，LI Qiao－ling，MO Mei－h(huán)ua
(College of Food Science，South China Agriculture University，Guangzhou 510642，China)

The life history and sexuality pattern of Volariella volvacea are still uncertain and unclear.13 single sexual spores were isolated from strain V23，and cultivated in liquid medium to obtain mycelia for DNA extraction.Internal Transcribed Spacers(ITS)of these 13 isolates and V23were amplified and sequenced with primer ITS4 and ITS5.All theses sequences had over 99%similarity to homologous sequence from Genbank with multiple alignments，only five transitions but no transversion had been observed between two sexual Generations of Volariella volvacea.Less variation inter sexual spores revealed that ITS sequence was not the perfect gene for genetic analysis of Volariella volvacea.The random amplified polymorphic DNA(RAPD)analysis was performed with 20 random primers and genomic DNA which isolated from the 13 single spore strains and parent strain V23，PCR with only 3 random primers showed polymorphic bands，and some genetic separation regularity revealed that RAPD analysis had much more important value on research of sexuality pattern of Volariella volvacea.

Volariella volvacea;ITS;RAPD;sequence analysis

Q789

A

1002－0306(2012)10－0198－04

2011－10－10

徐學(xué)鋒(1977－)，男，博士，研究方向:應(yīng)用真菌遺傳與生物技術(shù)。

國(guó)家自然科學(xué)基金(30800774);華南農(nóng)業(yè)大學(xué)校長(zhǎng)基金(2007K046)。