邱志敏，芮漢明

（華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州 510640)

微波輔助提取枸杞多糖的工藝優(yōu)化及其抗氧化性研究

邱志敏，芮漢明*

（華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州 510640)

利用響應(yīng)面法優(yōu)化枸杞多糖的微波輔助水提取工藝，得到最佳提取工藝為：微波功率300W，微波時間1.8min，液料比26∶1，枸杞粗多糖得率可以達(dá)到9.57%（w/w)。在此工藝條件下，微波提取枸杞多糖的DPPH·清除率比BHA低5%左右（0.1mg/mL濃度除外)，但ORAC值及抗油脂酸敗能力略高于BHA，總體來說抗氧化活性與水提多糖相近。

微波輔助提取，枸杞多糖，得率，抗氧化活性

枸杞子作為我國名貴的中藥材，具有很高的保健價值。枸杞多糖是枸杞中的主要生物活性成分，其組分之一LBP-4具有抑制人肝癌細(xì)胞增殖的作用[1]。枸杞多糖的提取一直是研究的熱點(diǎn)，使用最多的方法是水循環(huán)提取，雖然近年來也出現(xiàn)了超聲波[2-4]、微波[5]等技術(shù)輔助提取的報道，但僅限于得率方面的研究。微波提取最大的特點(diǎn)是速度快、節(jié)省溶劑、節(jié)省時間等，有利于避免長時間高溫引起的熱不穩(wěn)定物質(zhì)的分解破壞，特別適合用于天然物質(zhì)活性成分的提取[6]。自然界中氧化反應(yīng)很多都是有害反應(yīng)，如油脂變質(zhì)、食物褪色等，降低了食物的感官品質(zhì)和營養(yǎng)價值，甚至損害人體健康[7]。人體內(nèi)也存在很多自由基參與的氧化反應(yīng)，可損害機(jī)體的組織和細(xì)胞，引起慢性疾病及衰老效應(yīng)，而抗氧化劑能阻止氧化反應(yīng)的發(fā)生。在C.L.Lin[8]等的研究中，枸杞多糖對DPPH、ABTS等自由基具有很好的清除率，Bin Liang[9]等發(fā)現(xiàn)枸杞多糖能保護(hù)皮膚免受氧化損傷，故枸杞多糖的抗氧化研究及應(yīng)用將成為今后的熱點(diǎn)。因此，本文應(yīng)用響應(yīng)面法對微波輔助水提取枸杞多糖的工藝進(jìn)行了優(yōu)化，并在此基礎(chǔ)上對其抗氧化特性進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

枸杞 產(chǎn)于寧夏中寧;DPPH Sigma公司;熒光素鈉、ABAP 沈陽試劑三廠;其他試劑 均為分析純。

臺式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;722S型分光光度計 上海棱光技術(shù)有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海青浦滬西儀器廠;電子分析天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;微波化學(xué)反應(yīng)器MCR-3 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;CHRIST冷凍干燥機(jī) 博勵行儀器有限公司;雷勃MK3酶標(biāo)儀 上海普林斯頓生物科技發(fā)展有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 枸杞多糖提取工藝 微波法：枸杞子，干燥至水分含量6%，粉碎過60目篩，稱取5g以80%乙醇脫單糖，將脫單糖后的枸杞與不同比例的水混合置于微波化學(xué)反應(yīng)器中處理，然后將提取液過濾離心（4000r/min，10min)，使用硫酸-苯酚法測量多糖得率。

水提法：枸杞子，干燥至水分含量6%，粉碎過60目篩，稱取5g以80%乙醇脫單糖，80℃條件下熱水回流提取2h，測量步驟同微波法。

1.2.2 枸杞多糖的分離純化 枸杞多糖提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至原體積的1/5，加5倍體積95%乙醇，離心分離，濾渣加5倍體積的丙酮-石油醚混合液（體積比1∶1)脫色，過濾，得沉淀，以體積分?jǐn)?shù)95%乙醇，無水乙醇，丙酮洗滌，真空干燥，得到LBP粗品。LBP粗品以Seveg法脫蛋白[11-12]，連續(xù)三次，棄掉中間蛋白層，取上清液，濃縮，透析，冷凍干燥得精制LBP。

1.2.3 枸杞多糖微波提取單因素實驗 稱取60目枸杞粉1g，以水為溶劑，分別考察微波功率、微波時間、料液比對多糖提取率的影響，確定各因子的影響效果和適宜范圍。單因素實驗設(shè)計表見表1。

表1 微波輔助提取單因素實驗設(shè)計Table 1 Single factor experiment design of microwave-assisted extraction

1.2.4 枸杞多糖微波輔助提取響應(yīng)面實驗 以單因素實驗結(jié)果為參考，采用Box-Behnken實驗設(shè)計，分別以微波功率、微波時間和料液比為考察對象，以枸杞多糖得率為響應(yīng)值，設(shè)計三因素三水平響應(yīng)面分析，因素與水平設(shè)計見表2。

表2 微波輔助提取響應(yīng)面實驗Table 2 Response surface experiment of microwave-assisted extraction

1.2.5 枸杞多糖清除自由基能力的測定

1.2.5.1 清除DPPH自由基的測定[11]將枸杞多糖、BHA和VC分別配成1mg/mL的溶液，備用，另配制0.15mmol/L的DPPH乙醇溶液，避光保存。取相應(yīng)體積待測液加入2mL DPPH溶液于25℃反應(yīng)15min后，在517nm處測定吸光度As，以蒸餾水代替試樣為空白對照A0，蒸餾水代替DPPH溶液為樣品對照Ax，每個試樣作三個平行樣，取其平均值。清除自由基活性的計算公式：

1.2.5.2 ORAC值的測定 配制樣液、各緩沖溶液與標(biāo)準(zhǔn)溶液[13]，加20μL樣品、空白、Trolox標(biāo)準(zhǔn)或200μL熒光素溶液（F孔)到96孔板中反應(yīng)10min，每孔中加200μL熒光素溶液（除F孔之外)，蓋上96孔板，37℃反應(yīng)20min，加20μL ABAP溶液到每孔中，然后檢測熒光強(qiáng)度，每隔2min檢測一次，共檢測35次，記錄熒光強(qiáng)度值，計算熒光熄滅曲線下面積。

1.2.6 抗氧化實驗

1.2.6.1 枸杞多糖在植物油貯藏期間的抗氧化效果采用Schaal烘箱法[14]，稱取20g若干份大豆油，一份作為空白，其余分別加入枸杞多糖和BHA 2g，攪拌均勻后置于（60±0.5)℃恒溫培養(yǎng)箱中強(qiáng)化保存，每隔24h交換它們在培養(yǎng)箱中的位置，按GB/T5009.37-2003每隔3d取出部分測定其過氧化值（POV值)。

2 結(jié)果與分析

2.1 微波輔助提取條件對枸杞多糖得率的影響研究

2.1.1 微波功率對枸杞多糖得率的影響 由圖1可以看出，隨著微波功率的提高，枸杞多糖得率呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，且在微波功率為400W時得率最高。400W以后多糖得率下降的原因可能是因為過高的微波功率使多糖發(fā)生了分解[15]，且容易發(fā)生爆沸，造成多糖損失。黃文書[5]等也有相同的實驗結(jié)果，因此確定微波功率為400W。

圖1 微波功率對枸杞多糖得率的影響Fig.1 Influence of microwave power on the yield of polysaccharide from Lycium barbarum

2.1.2 微波處理時間對枸杞多糖得率的影響 由圖2可以看出，隨著微波時間的延長，枸杞多糖得率也是呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。在微波時間0.5～1.5min內(nèi)多糖得率顯著上升，微波時間在1.5～2min時，枸杞多糖得率最高，但2min與1.5min的結(jié)果沒有顯著差別，微波時間超過2min時，多糖得率又明顯下降。這可能是由于時間過長導(dǎo)致多糖水解程度增大，使得測量結(jié)果偏低。故從能耗及多糖得率方面考慮響應(yīng)面實驗選取最佳微波時間為1.5min。

圖2 微波處理時間對枸杞多糖得率的影響Fig.2 Influence of microwave time on the yield of polysaccharide from Lycium barbarum

2.1.3 液料比對微波提取枸杞多糖得率的影響 圖3中多糖得率隨著液料比的升高先升高而后降低，液料比小于20∶1時多糖得率增加不明顯，液料比從20∶1增加到30∶1時增加顯著，大于30∶1時又開始下降，液料比為40∶1時的多糖得率與30∶1時有顯著差別（p＜0.05)，所以響應(yīng)面實驗選取最佳液料比為30∶1，這樣既能保證一定的得率，又能減少后續(xù)濃縮操作難度，節(jié)省材料和能耗。

圖3 液料比對枸杞多糖得率的影響Fig.3 Influence of solution－solid ratio on the yield of polysaccharide from Lycium barbarum

2.2 微波提取枸杞多糖響應(yīng)面實驗

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，采用響應(yīng)面設(shè)計實驗，對微波功率（A)、微波時間（B)及液料比（C)作如下變換：X1=（A－400)/100，X2=（B－1.5)/0.5，X3=（C－30)/10。以X1、X2、X3為自變量，以枸杞多糖得率（Y)為響應(yīng)值，實驗方案及結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面實驗方案及結(jié)果Table 3 Program and result of response surface experiment

各因素經(jīng)二次多項回歸擬合后，得到枸杞多糖得率對微波功率、微波時間、液料比3個因素的二次多項回歸方程：

對該模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表4。由表4方差分析（ANOVA)可以看出：F回歸=9.05＞F0.01（9，7)=6.72，p值=0.0042＜0.01表明回歸方程極顯著，不同處理組的差異顯著;而F失擬=1.65＜F0.05（3，4)=24.26，失擬項的p值=0.3138＞0.05，故其不顯著;模型的確定系數(shù)（RSquared)R2=0.9208，說明該模型能解釋92.08%響應(yīng)值的變化，因而該模型擬合程度良好，實驗誤差比較小，可以用此模型對優(yōu)化水提取枸杞多糖進(jìn)行分析和預(yù)測。由回歸方程系數(shù)及其顯著性檢驗可知，三個因素對枸杞多糖得率的影響順序為：微波時間＞液料比＞微波功率，X2、X3、X32項極顯著，X22、X1X3項顯著，說明微波功率和液料比的交互作用影響顯著。通過回歸方程來繪制響應(yīng)面立體分析圖和等高線圖如圖4，考察所擬合的響應(yīng)曲面的形狀。等高線的形狀反映出交互作用的強(qiáng)弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則相反。當(dāng)液料比保持30∶1不變時，微波功率與微波時間對枸杞多糖得率的交互影響如圖4A所示，當(dāng)提取時間不變時，枸杞多糖得率隨著微波功率的增大而先增大后減小，但影響不顯著;多糖得率隨提取時間的增大而先增大后趨于平緩。微波功率與液料比的交互作用對枸杞多糖得率的影響顯著，如圖4B所示，較小的液料比改變就會引起較大的多糖得率變化。為進(jìn)一步確定最佳的提取工藝，在模型范圍內(nèi)對各工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，得到枸杞多糖的最佳提取工藝為微波功率300W，微波時間1.8min，液料比26∶1，在此工藝條件下枸杞多糖的得率為9.57%，比枸杞多糖在最佳水提工藝條件下的得率7.34%高30%。

表4 回歸方程及方差分析Table 4 Regression equation and variance analysis

圖4 因素及其交互作用響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface figure of factors and interaction

2.3 微波輔助提取所得枸杞多糖清除自由基的研究

圖5 枸杞多糖與其他抗氧化劑對DPPH·的清除效果Fig.5 DPPH·clearance of polysaccharide from Lycium barbarum and other antioxidants

由圖5可以看出，對于不同的抗氧化劑，隨著濃度的提高其DPPH自由基清除效果都逐漸提高。在低濃度范圍內(nèi)（0.1～0.2mg/mL)水提LBP的抗氧化活性較其他三種差，當(dāng)濃度升高時，其抗氧化活性增加顯著，超過了BHA和微波提取LBP的抗氧化活性。VC的抗氧化活性最高，其DPPH·清除率在80%以上，微波提取LBP的抗氧化活性與BHA相當(dāng)[8]，相差在5%之間（0.1mg/mL濃度除外)。

圖6 枸杞多糖與其他抗氧化劑對氧自由基的清除效果Fig.6 Oxygen radical clearance of polysaccharide from Lycium barbarum and other antioxidants

ORAC（Oxgen Radical Absorbance Capacity)指氧自由基吸收能力，已經(jīng)越來越多的被用來作為衡量物質(zhì)的抗氧化性標(biāo)準(zhǔn)。由圖6可以看出，四種抗氧化劑對氧自由基都有一定的吸收能力，其中以VC的吸收能力最強(qiáng)，其ORAC值顯著高于其他三種抗氧化劑。微波提取LBP的ORAC值比水提LBP高9.35%，比BHA高3.46%，但差異不顯著（p>0.05)。

2.4 微波輔助提取所得枸杞多糖對油脂的抗氧化性能研究

由圖7可知，抗氧化物質(zhì)能顯著降低大豆油在儲藏過程中的過氧化值。其中，VC對油脂過氧化值的降低作用最為明顯，添加了微波提取枸杞多糖與添加水提枸杞多糖的油脂過氧化值相似，其抗氧化能力與BHA相當(dāng)，說明三者抗油脂酸敗能力相近。

圖7 枸杞多糖與其他抗氧化劑對大豆油在60℃下過氧化值的影響Fig.7 Influence on soybean oil’s peroxide value at 60℃of polysaccharide from Lycium barbarum and other antioxidants

3 結(jié)論

3.1 利用微波輔助水提取枸杞多糖，以多糖得率為指標(biāo)，使用響應(yīng)面法對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得出最佳提取工藝為微波功率300W，微波時間1.8min，液料比26∶1，多糖得率9.57%，在此條件下進(jìn)行3次驗證實驗，平均相對誤差為2.19%。

3.2 采用多種體系對微波提取枸杞多糖的抗氧化性能進(jìn)行考察，結(jié)果表明微波法、水提法枸杞多糖與BHA具有相近的抗氧化能力，其DPPH·清除率、ORAC值及抗油脂酸敗能力在100%±10%之間，但弱于VC的抗氧化能力。

3.3 微波法提取枸杞多糖能有效提高提取率，降低能耗，抗氧化活性與水提法相當(dāng)。

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Study on optimization of microwave-assisted extraction of polysaccharide from Lycium barbarum and research of its antioxidizability

QIU Zhi-min，RUI Han-ming*
（College of Light Industry and Food Sciences，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China)

Response surface analysis method was used to optimize microwave extraction of polysaccharide fromLycium barbarum.Results showed that the best extraction conditions were as follows：the highest yield（9.57%（w/w))of the polysaccharide was obtained under 300W of microwave power for 1.8min at solution-solid ratio of 26∶1（mL/g).The DPPH·clearance rate of the polysaccharide yielded under optimum conditions was 5% lower than BHA（0.1mg/mL concentration except)，but the ORAC value and reducing power of the polysaccharide were slightly higher.On the whole，its antioxidizability was close to the polysaccharide yield by water extraction.

microwave-assisted extraction;polysaccharide ofLycium Barbarum;yield;antioxidizability

TS201.1

B

1002-0306（2012)07-0220-05

2011－07－18 *通訊聯(lián)系人

邱志敏（1988－)，男，碩士研究生，研究方向：食品加工與保藏。