吳金鳳，李學(xué)剛，戴 亞，朱立軍，譚蘭蘭

(1.西南大學(xué)藥學(xué)院，重慶 400716;2.重慶煙草工業(yè)有限責(zé)任公司重慶卷煙廠，重慶 400061; 3.川渝中煙工業(yè)公司技術(shù)研發(fā)中心，四川成都 610066)

黃連生物堿降低卷煙主流煙氣中苯并［α］芘的研究

吳金鳳1，2，李學(xué)剛1，*，戴 亞3，朱立軍3，譚蘭蘭3

(1.西南大學(xué)藥學(xué)院，重慶 400716;2.重慶煙草工業(yè)有限責(zé)任公司重慶卷煙廠，重慶 400061; 3.川渝中煙工業(yè)公司技術(shù)研發(fā)中心，四川成都 610066)

為研究植物生物堿對卷煙主流煙氣中苯并［α］芘含量的降低作用，從含有大量異喹啉結(jié)構(gòu)季銨堿的黃連根莖中提取出黃連總生物堿及其單體，采用苯并［α］芘熒光淬滅實(shí)驗(yàn)研究黃連生物堿對苯并［α］芘的清除作用，通過不同添加方式將黃連生物堿添加在卷煙濾嘴中，研究其對卷煙煙氣中苯并［α］芘的降低作用。結(jié)果表明，黃連生物堿對苯并［α］芘的結(jié)合常數(shù)為(2.0～9.0)×103，相關(guān)系數(shù)為0.987～0.998，黃連生物堿對苯并［α］芘的清除能力大小依次為巴馬汀＞黃連總生物堿＞小檗堿＞黃連堿;隨著濾嘴中黃連生物堿添加量的增加，煙氣中苯并［α］芘的含量降低，活性炭纖維載體可提高黃連生物堿對卷煙煙氣中苯并［α］芘的降低率。卷煙濾嘴中添加負(fù)載120mg/g巴馬汀的ACF 15mg/cig制成黃連生物堿復(fù)合濾嘴，與空白對照卷煙比，煙氣中苯并［α］芘的降低率可達(dá)25.16%。

卷煙，黃連生物堿，煙氣，苯并［α］芘

卷煙煙氣成分非常復(fù)雜，吸煙不僅對吸煙者的健康產(chǎn)生危害，也對大氣環(huán)境造成污染。流行病學(xué)研究表明，與吸煙相關(guān)的疾病包括心血管疾病、肺癌、慢性支氣管炎、慢性阻塞性肺病(COPD)以及肺氣腫等［1］。卷煙煙氣是造成室內(nèi)空氣污染的一大源頭，因此吸煙者的吸煙行為對不吸煙人群也會造成肺部功能損傷和誘發(fā)癌癥［2］。雖然降低這些疾病發(fā)生率的最好方式是減少吸煙人數(shù)，但現(xiàn)今全球仍有約10億人吸煙，其中中國吸煙者占三分之一［3］。由此可見，降低卷煙煙氣有害成分對吸煙者、非吸煙者和環(huán)境都具有重要意義。近年來，卷煙煙氣中的有害成分研究日益活躍。卷煙煙氣中含有的苯并［α］芘被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)列為第一類致癌物，與吸煙者肺部、口腔、食道、胰腺和肝臟等部位的疾病密切相關(guān)［1］。我國擁有豐富的中草藥資源及中醫(yī)理論基礎(chǔ)，篩選具有選擇性降低卷煙煙氣中有害成分的中草藥，并用于減輕吸煙對健康的危害是發(fā)展低危害中式卷煙特色之路［4－5］。黃連是一味古老的清熱解毒的傳統(tǒng)中藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，口服安全無毒，已有上千年的食用歷史［6］，主要分布于長江中上游的重慶、湖北等地［7］。黃連根莖含多種異喹啉生物堿，以小檗堿含量最高，其次是巴馬汀、黃連堿、藥根堿等結(jié)構(gòu)相似的生物堿。這類生物堿均由兩個異喹啉環(huán)稠合而成，結(jié)構(gòu)中含有氮雜環(huán)和季銨鹽結(jié)構(gòu)，是一類具有抗氧化活性的生物堿［8－9］。將含有季銨基團(tuán)的黃連生物堿添加在濾嘴中，研究其對卷煙煙氣中苯并［α］芘的清除作用，旨在為植物生物堿在卷煙降焦減害中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃連 重慶石柱黃連GAP基地;鹽酸小檗堿中國食品藥品檢定研究院，標(biāo)準(zhǔn)品;活性炭纖維氈江蘇科凈纖維有限公司;甲醇 色譜純，美國Fisher公司;環(huán)己烷 色譜純，德國DMA公司;苯并［α］芘、9－苯基蒽 標(biāo)準(zhǔn)品，美國Accustandard公司;“嬌子”卷煙 由川渝中煙工業(yè)公司提供。

RE－52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠; 95－2恒溫磁力攪拌器 常州澳華儀器有限公司; LC－6AD型高效液相色譜系統(tǒng) 日本島津公司; F－4500型熒光分光光度計(jì) 日本HITACHI公司; RM20/CS轉(zhuǎn)盤型吸煙機(jī) 德國 Borgwaldt公司; HP6890GC/5973MSD氣相色譜－質(zhì)譜儀 美國Agilent公司;D200H超聲波發(fā)生器 臺灣臺達(dá)公司，V－805/R－205真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士Buchi公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黃連生物堿的提取及測定 采用參考文獻(xiàn)［10］中的方法對黃連根莖進(jìn)行生物堿提取，將提取的黃連總生物堿及生物堿單體干燥后密封備用。采用參考文獻(xiàn)［11］中的方法，以鹽酸小檗堿為對照品，對提取的黃連總生物堿進(jìn)行成分及其含量的檢測［12］，測定所提取的巴馬汀、小檗堿和黃連堿的純度。

1.2.2 黃連生物堿清除苯并［α］芘的作用 將苯并［α］芘標(biāo)準(zhǔn)品配制成質(zhì)量濃度為100μg/m L的溶液，黃連生物堿配制成不同濃度的溶液。參考文獻(xiàn)［13］，通過熒光掃描找出本實(shí)驗(yàn)條件下檢測苯并［α］芘的激發(fā)波長 387nm，發(fā)射波長402nm。在4.9m L乙醇溶液中加入0.1m L 100μg/m L的苯并［α］芘溶液并檢測其熒光強(qiáng)度F0;在4.8m L乙醇溶液中分別加入0.1m L 100μg/m L的苯并［α］芘溶液和0.1m L不同濃度的黃連生物堿溶液后檢測熒光強(qiáng)度F。黃連生物堿對苯并［α］芘的熒光淬滅作用可以通過下列Stern－Volmer方程計(jì)算其結(jié)合常數(shù)［14］，結(jié)合常數(shù)越大，生物堿與苯并［α］芘的作用就越強(qiáng)。

式中:F0:沒有熒光猝滅的苯并［α］芘熒光強(qiáng)度; F:產(chǎn)生了熒光猝滅的苯并［α］芘熒光強(qiáng)度;KSV:指結(jié)合常數(shù)(猝滅常數(shù));［Q］:指猝滅劑濃度。

1.2.3 黃連生物堿粉末在濾嘴中直接添加方式 參考文獻(xiàn)［15］中植物提取物在卷煙濾嘴中的添加方式和添加量，抽出醋纖濾嘴卷煙中的醋纖絲束形成濾嘴空孔，在留出的濾嘴空孔內(nèi)分別添加5、10、15、20mg/cig提取的黃連生物堿粉末，然后將醋纖絲束裝回濾嘴空孔內(nèi)復(fù)原。

1.2.4 黃連生物堿載體的選擇及復(fù)合濾嘴制作方式

活性炭纖維(ACF)是一種具有較大的比表面積(1500m2/g)以及較大的微孔容積(0.592cm3/g)的材料，因此具有吸附量大，吸附速度快等優(yōu)勢。ACF因外觀類似于醋酸纖維絲束，相對易滿足在濾嘴上的使用要求［16］，因此選用ACF作為黃連生物堿的載體。每支濾嘴中添加15mg ACF，根據(jù)濾嘴中需添加黃連生物堿的量，配制不同濃度的黃連生物堿溶液，100m L生物堿溶液使用0.5g ACF材料在40℃水溫下攪拌吸附90min，分別制成ACF負(fù)載黃連生物堿的量為20、40、60、80、100、120mg/g的濾嘴添加材料。將通過以上處理的ACF材料剪切成與卷煙濾嘴截面尺寸相同的圓片，抽出醋纖濾嘴卷煙中的醋纖絲束，將其切成兩段，將處理后的ACF材料夾在兩段醋纖棒的中間，依次塞入濾嘴空孔內(nèi)，切去多出原濾嘴的長度，保證載體加入后濾嘴總長度不變［17］。

1.2.5 卷煙煙氣中苯并［α］芘釋放量的檢測 根據(jù)參考文獻(xiàn)［18］，測定卷煙主流煙氣中苯并［α］芘的釋放量。

2 結(jié)果與討論

2.1 黃連生物堿成分測定結(jié)果

以鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品為對照，采用HPLC法檢測分析出提取的黃連總生物堿含小檗堿35.01%、黃連堿20.81%、巴馬汀11.93%、表小檗堿7.85%和藥根堿4.34%。從黃連總生物堿中分離提取出3種純度為95%以上的黃連生物堿，分別為小檗堿、巴馬汀和黃連堿。黃連總生物堿中分析出的單體均為異喹啉結(jié)構(gòu)的季銨堿。

2.2 黃連生物堿清除苯并［α］芘的作用

隨著黃連總生物堿及其單體的濃度增加，苯并［α］芘的熒光強(qiáng)度減弱，黃連總生物堿及其單體對苯并［α］芘都具有熒光猝滅作用，根據(jù)各濃度生物堿樣品對苯并［α］芘的熒光淬滅的強(qiáng)度，擬合出黃連生物堿對苯并［α］芘的熒光淬滅的Stern－Volmer方程，見表1。黃連總生物堿及三種黃連生物堿單體與苯并［α］芘的結(jié)合常數(shù)(KSV)為(2.0～9.0)×103，方程相關(guān)系數(shù)(R)為0.987～0.998，根據(jù)KSV可以推斷，黃連生物堿對苯并［α］芘猝滅作用大小順序?yàn)榘婉R汀＞黃連總生物堿＞小檗堿＞黃連堿。從相關(guān)系數(shù)可以看出，黃連生物堿濃度對苯并［α］芘的熒光淬滅作用具有較強(qiáng)的相關(guān)性。

2.3 黃連生物堿降低卷煙煙氣中苯并［α］芘的作用

與未添加黃連生物堿的卷煙，濾嘴添加了黃連生物堿的卷煙煙氣中苯并［α］芘含量有不同程度的降低，見圖1。從圖1可以看出，隨著濾嘴中添加生物堿的量增加，苯并［α］芘的降低率增大，當(dāng)濾嘴中生物堿的添加量為20mg/cig時，黃連總生物堿、巴馬汀、小檗堿和黃連堿對苯并［α］芘的降低率分別為20.04%、22.65%、17.57%和7.75%。將黃連總生物及其單體添加在濾嘴中，其降低卷煙煙氣中苯并［α］芘的作用大小與溶液中對苯并［α］芘熒光淬滅作用強(qiáng)弱相一致，對煙氣中苯并［α］芘的降低率強(qiáng)弱依次為巴馬汀＞黃連總生物堿＞小檗堿＞黃連堿。

表1 黃連生物堿對苯并［α］芘的熒光猝滅作用Table 1 The effect of coptis alkaloids on fluorescence quenching of B［α］P

圖1 黃連總生物堿及其單體對卷煙煙氣中苯并［α］芘的降低作用Fig.1 The effect of total alkaloids and monomer of coptis alkaloids on the reduction of B［α］P in the cigarette smoke

2.4 黃連生物堿復(fù)合濾嘴對卷煙煙氣中苯并［α］芘的作用

通過比較黃連總生物堿及其單體對苯并［α］芘清除能力，選擇對苯并［α］芘清除率最大的巴馬汀通過ACF負(fù)載制成生物堿復(fù)合濾嘴，ACF分別負(fù)載巴馬汀0、20、40、60、80、100、120mg/g后制成復(fù)合濾嘴卷煙，卷煙濾嘴中ACF的添加量均為15mg/cig，檢測黃連生物堿通過ACF負(fù)載后添加在濾嘴中對苯并［α］芘的清除效果，以巴馬汀負(fù)載量為0的ACF制成復(fù)合濾嘴卷煙樣品為空白對照，將其煙氣中苯并［α］芘含量記為100%，計(jì)算濾嘴中生物堿的添加量對煙氣中苯并［α］芘含量的影響，見圖2。

圖2 巴馬汀通過ACF負(fù)載后添加到濾嘴中對煙氣中苯并［α］芘的清除效果Fig.2 Reduction of B［α］P in the cigarette smoke by addition of Palmatine loaded on the ACF in the filter

從圖2可以看出，隨著濾嘴中ACF負(fù)載巴馬汀的量增加，生物堿復(fù)合濾嘴對卷煙煙氣中苯并［α］芘的降低量越大，當(dāng)ACF負(fù)載巴馬汀的量大于80mg/g后，巴馬汀的增加對苯并［α］芘的清除效果減弱。當(dāng)添加ACF負(fù)載巴馬汀的量為120mg/g制成的生物堿復(fù)合濾嘴卷煙，與未負(fù)載生物堿的ACF復(fù)合濾嘴卷煙比較，煙氣中苯并［α］芘的量降低了25.16%，該條件下濾嘴中實(shí)際添加巴馬汀的量為1.8mg/cig。由此可見，與直接添加黃連生物堿粉末制成的生物堿濾嘴降低煙氣中苯并［α］芘的作用比較，由于載體材料ACF具有巨大的比表面積，可使黃連生物堿在濾嘴中擴(kuò)散分布來增大和延長與煙氣的接觸面積和時間，采用ACF材料負(fù)載后添加到濾嘴中可提高黃連生物堿對煙氣中苯并［α］芘的清除效率。

黃連生物堿與苯并［α］芘的結(jié)合機(jī)理可能在于黃連生物堿異喹啉結(jié)構(gòu)中共軛π－π鍵與苯并［α］芘中大量的π電子發(fā)生共軛效應(yīng)，這種共軛效應(yīng)使得黃連生物堿對苯并［α］芘具有識別性結(jié)合作用［19］。另外，處于缺電子狀態(tài)的季銨離子易與苯并［α］芘的π電子結(jié)合［20］，從而增加了黃連生物堿與苯并［α］芘的結(jié)合強(qiáng)度。

3 結(jié)論

3.1 從黃連根莖中提取生物堿可以得到大量異喹啉結(jié)構(gòu)的生物堿，通過酸水提取法和大孔樹脂純化，本實(shí)驗(yàn)提取到含小檗堿35.01%、黃連堿20.81%、巴馬汀11.93%、表小檗堿7.85%和藥根堿4.34%的黃連總生物堿，以及純度在95%以上黃連生物堿單體，即小檗堿、巴馬汀和黃連堿。

3.2 將黃連總生物堿及其單體用于苯并［α］芘熒光淬滅實(shí)驗(yàn)，黃連總生物堿及其單體的濃度對苯并［α］芘熒光淬滅作用顯著相關(guān)，通過計(jì)算結(jié)合常數(shù)，黃連生物堿對苯并［α］芘清除作用的大小依次為巴馬?。军S連總生物堿＞小檗堿＞黃連堿。

3.3 通過比較黃連生物堿在濾嘴中不同的添加方式，采用具有巨大比表面積和大量微孔的ACF材料負(fù)載黃連生物堿可顯著提高添加在濾嘴中的黃連生物堿對煙氣中苯并［α］芘的清除效率。

［1］Chen R J，Chang L W，Lin P，et al.Epigenetic effects and molecular mechanisms of tumorigenesis induced by cigarette smoke:An overview［J］.JOncol，2011，2011:1－14.

［2］Hersoug L G，Husemoen L L，Sigsgaard T.Indoor exposure to environmental cigarette smoke，but not other inhaled particulates associateswith respiratory symptoms and diminished lung function in adults［J］.Respirology，2010，15(6):993－1000.

［3］ Wald N J，Hackshaw A K.Cigarette smoking:an epidemiological overview［J］.Br Med Bull，1996，52(1):3－11.

［4］孟冬玲，劉紹華.中草藥添加劑在中國卷煙中的應(yīng)用研究進(jìn)展［J］.中國煙草科學(xué)，2006(3):19－21.

［5］張穎璞，陳篤建，張國強(qiáng)，等.中草藥在中式低危害卷煙中的應(yīng)用［J］.科技信息，2008(11):33－34.

［6］張瑞芬，蘇和.黃連的藥理研究進(jìn)展［J］.內(nèi)蒙古中醫(yī)藥，2010(3):114.

［7］龔傳秀.重慶市野生黃連形態(tài)分化和藥效成分與環(huán)境因子的關(guān)聯(lián)性研究［D］.重慶:西南大學(xué)，2007.

［8］袁王俊，李彩芳，丁秋瑾，等.黃連抗氧化活性研究［J］.廣西植物，2009(5):694－697.

［9］Shirwikar A，Rajendran K.In vitro antioxidant studies on benzyl tetra isoquinoline alkaloid berberine［J］.Biol Pharm Bull，2006，29(9):1906－1910.

［10］楊勇.黃連生物堿的提取及降糖活性研究［D］.重慶:西南大學(xué)，2009.

［11］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2010年版一部［M］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:285.

［12］匡艷輝，朱晶晶，王智民，等.一側(cè)多評法測定黃連中小檗堿、巴馬汀、黃連堿、表小檗堿、藥根堿的含量［J］.中國藥學(xué)雜志，2009，44(5):389－394.

［13］劉少民，陶寧，戴亞，等.熒光光度法測定卷煙煙氣中3，4－苯并［α］芘［J］.中國煙草科學(xué)，2001(2):15－18.

［14］張冰衛(wèi)，李博，夏文水，等.用熒光光譜法研究分子間結(jié)合常數(shù)和結(jié)合為點(diǎn)數(shù)時的公式選擇［J］.藥學(xué)進(jìn)展，2011，3 (7):296－303.

［15］Alexandrov K，Rojas M，Rolando C.DNA damage by benzo (a)pyrene in human cells is increased by cigarette smoke and decreased by a filter containing rosemary extract，which lowers free radicals［J］.Cancer Res，2006，66(24):11938－11945.

［16］于濤，張杰，曹建華，等.活性炭纖維在卷煙濾嘴方面的應(yīng)用研究進(jìn)展［J］.中國煙草學(xué)報，2009，15(4):82－85.

［17］許愛琴.應(yīng)用改性ACF選擇性降低卷煙煙氣中的CO［D］.南京:南京師范大學(xué)，2007.

［18］GB/T 201130－2007卷煙煙氣總粒相物中苯并［α］芘的測定［S］.北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2007.

［19］Tsuzuki S，Honda K，Uchimaru T，et al.Origin of attraction and directionality of the pi/pi interaction:model chemistry calculations of benzene dimer interaction［J］.J Am Chem Soc，2002，124，104－112.

［20］Aschi M，Mazza F，Nola，A D.Cation– πinteractions between ammonium ion and aromatic rings:an energy decomposition study［J］.Journal of Molecular Structure－Theochem，2002，587，177－188.

Study on the effect of coptis alkaloids on the decrease of benzo［α］pyrene in cigarette smoke

WU Jin-feng1，2，LIXue-gang1，*，Dai Ya3，ZHU Li-jun3，TAN Lan-lan3
(1.College of Pharmaceutical Sciences，Southwest University，Chongqing 400716，China;2.Chongqing Branch Factory of Chongqing Tobacco Industrial Co.，Ltd.，China Tobacco Chuanyu Industrial Corporation，Chongqing 400061，China; 3.Technical R＆D Center of China Tobacco Chuanyu Industrial Corporation，Chengdu 610066，China)

For reducing the content of benzo［α］pyrene(B［α］P)in the mainstream cigarette smoke(MSS)，a novel filter additive containing the p lantalkaloid was studied.Cop tis alkaloids were extracted from rhizome of cop tis chinensis，which contained a lot of the quaternary ammonium hyd rate w ith isoquinoline struc ture.The interac tions of cop tis alkaloids w ith B［α］P was investigated by fluorescence quenching.The way of add ing cop tis alkaloids in the cigarette filter to reducing B［α］P were discussed.The results showed that the correlation coefficients of cop tis alkaloids and B［α］P were 0.981～0.998，and the b ind ing constants were(2.0～9.0)×103，more than 20%of B［α］P were elim inated from MSS，w ith g reater reductions when more cop tis alkaloids were added in the filter.With the same mass of cop tis alkaloids in the filter，the reduc tion trend for B［α］P was palmatine＞cop tis total alkaloids＞berberine＞cop tisine.Com paring w ith the control cigarette，the content of B［α］P in the mainstream smoke of cigarette w ith palmatine in mod ified filterwere reduced by 25.16%，when the filter containing 120mg/g of palmatine carried by 15mg/cig of ac tivated carbon fiber.

cigarette;cop tis alkaloids;smoke;benzo［α］pyrene

TS41+1

A

1002－0306(2012)12－0102－04

2012－03－12 *通訊聯(lián)系人

吳金鳳(1982－)，女，博士研究生，研究方向:卷煙工藝與天然產(chǎn)物化學(xué)研究。

川渝中煙工業(yè)公司科技項(xiàng)目(2010347)。