錢韻芳，謝 晶，吳文惠

（上海水產(chǎn)品加工與保藏工程中心，上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306）

蝦類保藏過程中酚氧化酶酶促黑變作用機(jī)理及其抑制方法的研究進(jìn)展

錢韻芳，謝 晶*，吳文惠

（上海水產(chǎn)品加工與保藏工程中心，上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306）

在蝦類貯藏過程中，蝦體的黑變嚴(yán)重影響了蝦的感官品質(zhì)，酚氧化酶是催化酪氨酸等色原物質(zhì)轉(zhuǎn)化為黑色素造成蝦體黑變的主要因素。文章綜述了國內(nèi)外酚氧化酶的形成機(jī)制研究現(xiàn)狀，重點敘述了蝦類中酚氧化酶的特性及抑制蝦類黑變方法的研究進(jìn)展，為蝦類貯藏保鮮技術(shù)的研發(fā)與改進(jìn)提供參考。

蝦，黑變，酚氧化酶，機(jī)理，防黑變方法

蝦是一種肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)豐富的水產(chǎn)品，深受廣大消費者喜愛。然而蝦肉中蛋白質(zhì)含量較高，為微生物的生長繁殖提供了有利條件。因此，蝦類在保藏過程中易受微生物的侵染而腐敗變質(zhì)。此外，蝦肉中含有酚氧化酶（Phenoloxidase，PO），在酚氧化酶作用下，蝦體中的單酚類化合物氧化生成無色的醌類物質(zhì)，醌類物質(zhì)再轉(zhuǎn)化形成黑色聚合物，導(dǎo)致蝦體黑變[1]。蝦類保藏、銷售過程中，蝦體黑變是影響蝦類外觀品質(zhì)、降低蝦類產(chǎn)品商品價值的主要因素。因此，在蝦類保藏過程中，除了抑制微生物的生長繁殖，還需采取有效措施防止蝦體黑變。了解蝦體中酚氧化酶的理化、生物特性及其作用底物和蝦類黑變產(chǎn)生機(jī)制，可以為探尋有效防止蝦類黑變的新途徑提供方向。本文綜述了蝦類酚氧化酶的理化特性、蝦體中黑色素形成機(jī)理以及防黑變劑和加工方法在防蝦體黑變中應(yīng)用的研究進(jìn)展，以期為蝦類產(chǎn)品保藏技術(shù)的開發(fā)提供參考。

1 酚氧化酶概述

1.1 酚氧化酶的定義和分類

酚氧化酶是一類廣泛存在于甲殼綱動物、果蔬、甚至人體皮膚中的含銅金屬酶，同時也是引起甲殼綱動物黑變、果蔬褐變[2-3]以及人體皮膚黑色素沉淀[4]的關(guān)鍵酶。

按照催化底物酚基數(shù)量的不同，酚氧化酶可分為單酚氧化酶（Monophenoloxidase，EC 1.14.18.1）、雙酚氧化酶（o-diphenoloxidase，EC 1.10.3.1）和漆酶（Laccases，EC 1.10.3.2）[5]。

自然界中存在多種酚氧化酶的同工酶。不同來源的酚氧化酶的名稱因作用底物不同而不同，蝦類中存在的單酚酶以酪氨酸為主要底物，因此又稱為酪氨酸酶（Tyrosinase），雙酚酶則又被稱為兒茶酚酶（Catecholoxidase）[6]。研究發(fā)現(xiàn)，單酚酶同時具有雙酚酶活性[7]，因此蝦類中的酚氧化酶一般又可稱為酪氨酸酶。

1.2 酚氧化酶的結(jié)構(gòu)特點與生化特性

目前，相關(guān)科研工作者還沒有提取到較純的酚氧化酶結(jié)晶，因此對于酚氧化酶空間結(jié)構(gòu)的研究報道較少。但研究認(rèn)為酚氧化酶原序列中有兩個銅離子結(jié)合位點（CuA和CuB），每個位點由3個保守的組氨酸殘基和1個銅離子以非共價鍵連結(jié)而成，每兩個銅離子能夠束縛一個氧分子[8]。當(dāng)酚氧化酶催化酪氨酸等底物時，底物中的羥基先與該活性中心的原子鍵合發(fā)生作用[9-10]。

酚氧化酶的分子量、最適pH、溫度等生化特性與蝦的種類有關(guān)。表1列出了幾種蝦類酚氧化酶的分子量大小、最適pH和最適溫度。

2 酚氧化酶的生理學(xué)作用與激活機(jī)制

2.1 酚氧化酶的生理學(xué)作用

要尋求能夠有效抑制酚氧化酶的方法，首先需要了解酚氧化酶的生理學(xué)作用。一般研究認(rèn)為，酚氧化酶參與了生物體免疫和自身識別系統(tǒng)[18-19]生理作用，包括以下兩點：a.參與甲殼動物的外殼硬化；b.修復(fù)傷口：蝦類等甲殼動物都通過醌類聚合過程生成抗菌化合物來幫助傷口愈合。

2.2 酚氧化酶的激活機(jī)制

在節(jié)肢動物中，酚氧化酶一般以無活性的酚氧化酶原（Prophenoloxidase，pro-PO）的形式存在于血細(xì)胞中，與模式識別蛋白、絲氨酸蛋白酶等一同構(gòu)成了復(fù)雜的酚氧化酶原激活系統(tǒng)。研究發(fā)現(xiàn)一些外源多糖（微生物細(xì)胞壁的主要成分）能夠刺激凡納濱對蝦的免疫活性[20]，如酵母多糖（提取自啤酒糖酵母）、葡聚糖（提取自啤酒糖酵母菌）、脂多糖（提取自大腸桿菌O111）、肽聚糖（提取自橙黃微球菌）等。這些多糖類物質(zhì)能與分子識別蛋白結(jié)合，激活酚氧化酶原，其中以肽聚糖的作用最為顯著。

血藍(lán)蛋白是一種存在于節(jié)肢動物血淋巴中的藍(lán)色、含銅、類似血紅蛋白功能的攜氧蛋白質(zhì)，與酚氧化酶（PO）具有較高的同源性，尤其活性位點的相似度很高。有研究表明，在一定條件下，血藍(lán)蛋白在胰蛋白酶水解下能夠表現(xiàn)出酚氧化酶的活性[21-22]。因此，血藍(lán)蛋白可能是節(jié)肢動物血淋巴的酚氧化酶原[23-24]。

2.3 酚氧化催化黑色素合成路徑

酚氧化酶催化酚類化合物生成無色醌類物質(zhì)，這些醌類物質(zhì)在非酶促反應(yīng)下聚合生成黑色素（反應(yīng)過程見圖1），并釋放抑菌物質(zhì)[25-27]。由此可見，酚氧化酶原激活系統(tǒng)是活體蝦及其他節(jié)肢動物起保護(hù)作用的一種免疫反應(yīng)機(jī)制。

我國是一個地域廣大的統(tǒng)一多民族國家,悠久的歷史與文化在建筑上形成了不同地域迥異的建筑形式和風(fēng)格,例如徽派建筑、福建土樓等等,共同構(gòu)成了我國豐富多彩的傳統(tǒng)民居。這些傳統(tǒng)民居反映了一個地區(qū)特有的自然、社會、歷史、文化，是我國建筑文化的重要標(biāo)志。

圖1 酪氨酸氧化生成黑色素反應(yīng)路徑[9]Fig.1 Formation ofmelanin from tyrosine[9]

3 國內(nèi)外蝦類黑變抑制方法研究進(jìn)展

3.1 蝦類黑變抑制劑

由于苯醌類物質(zhì)的聚合反應(yīng)是非酶促反應(yīng)，因此抑制黑變的研究以抑制前體物質(zhì)的形成為主。酚氧化酶的抑制方法可分為可逆型抑制和不可逆型抑制兩大類，其中可逆型抑制又可分為競爭性抑制、非競爭性抑制和反競爭性抑制。目前，國內(nèi)外學(xué)者主要使用還原劑與抗氧化劑、隔氧成膜劑、金屬離子螯合劑以及酚氧化酶結(jié)構(gòu)類似物等防黑變劑來防止或延緩蝦體死后黑變。

3.1.1 還原劑與抗氧化劑 二氧化硫產(chǎn)生物（亞硫酸鹽、焦性亞硫酸鹽等）是使用較為普遍和有效的蝦類黑變抑制劑[28]。然而，亞硫酸鹽添加到食品中存在嚴(yán)重的安全隱患，低劑量SO2仍可能引起部分人群發(fā)生頭暈、腹痛、惡心甚至過敏性休克等癥狀[29-30]。聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織以及美國、日本、歐盟等國家都嚴(yán)格規(guī)定了蝦肉中SO2的殘留量不得超過0.1mg/g[31]。

抗壞血酸（L-ascorbic acid，Vitam in C）又稱維生素C。因其具有較強(qiáng)的還原性和安全性，以及能夠防止黑色素沉集而應(yīng)用在蝦類防黑變中。研究表明抗壞血酸能夠?qū)⒈锦€原成雙酚[32]。但也有研究認(rèn)為在蝦類的保藏過程中添加抗壞血酸會使蝦體產(chǎn)生特殊的黃色，影響蝦的感官品質(zhì)[33]。異抗壞血酸是抗壞血酸的D型異構(gòu)體。雖然異抗壞血酸不具備抗壞血酸的生理功能，但是具有和抗壞血酸近似的抗氧化性而被用于防止蝦類貯藏過程中產(chǎn)生的黑變。

巰基化合物如半胱氨酸、谷胱甘肽等在生物體中參與氧化還原反應(yīng)。其中半胱氨酸是人體非必需氨基酸，而谷胱甘肽是由谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸3個氨基酸脫水縮合而成，能夠抑制日本對蝦的黑變[34]。

表1 部分種屬蝦類酪氨酸酶的生化特性Table 1 Physiochemical properties of polyphenol oxidase from different shrimp species

3.1.2 隔氧成膜劑 可食性涂膜抑制蝦類黑變的主要作用原理是阻隔蝦類與氧氣、水以及空氣中微生物的接觸[35]，因而對蝦體酚類物質(zhì)的氧化和黑變起到一定的抑制作用[36]。

生物涂膜劑按其成分組成可分為多糖類膜、蛋白類膜、脂質(zhì)類膜以及復(fù)合膜等[37]。其中殼聚糖抑制甲殼動物黑變的效果較明顯，研究認(rèn)為這可能是因為殼聚糖聚合物帶有正電荷，能夠吸附帶負(fù)電荷的多酚氧化酶中間產(chǎn)物或底物，并中和了負(fù)電荷，從而降低了多酚氧化酶與底物結(jié)合的概率[38]，從而抑制了蝦類的黑變。

3.1.3 金屬離子螯合劑 酚氧化酶的活性中心有兩個銅離子，能夠結(jié)合氧分子，為底物氧化提供氧。如果酚氧化酶的Cu脫離酶活性中心，酚氧化酶則無法結(jié)合氧分子催化氧化反應(yīng)。金屬離子螯合劑就是針對這一原理來降低酚氧化酶活性的。目前，常用于防止蝦類黑變的金屬離子螯合劑有乙二胺四乙酸（EDTA）[39]、植酸[40]、曲酸[41]、鞣酸等。

芳香族羧酸類化合物如苯甲酸、肉桂酸系化合物等，也是一類酚氧化酶的底物類似物。研究發(fā)現(xiàn)肉桂酸及其衍生物[44]、阿魏酸[45]、芥子酸[46]、香豆酸[47]、含羞草酸[48]等都有鈍化酚氧化酶的作用。

3.1.5 天然混合物抑制劑 近年來隨著食品添加劑安全問題越來越受公眾關(guān)注，源自天然物提取的蝦類黑變抑制劑因其安全無害而得到越來越廣泛的研發(fā)和應(yīng)用，部分植物來源的酪氨酸酶抑制劑見表2。

研究表明，很多天然提取物對蝦體黑變起到了一定的抑制作用，如：綠茶提取物[49]、葡萄籽提取物[50]、銀合歡種子提取物[51]等。這些天然提取物的有效成分多為多酚類抗氧化劑，如兒茶素[54-55]、原花青素[56]，以及如槲皮素[57]、蘆丁[58]等黃酮類化合物。它們不僅具有很強(qiáng)的還原性，能夠清除自由基，而且水溶液穩(wěn)定性較抗壞血酸好，還有螯合銅離子和抑菌能力[59]，因此對蝦類酚氧化酶的抑制類型多為混合型?；鹧孀犹崛∥镏泻械亩祁惢衔飫t不與酚氧化酶的活性中心結(jié)合，為非競爭性抑制[52]。然而，由于這些提取物成分過于復(fù)雜，天然抗氧化劑的作用機(jī)理尚不明確，目前尚難從這些混合物中確定對蝦類黑變抑制起主導(dǎo)作用的化合物。

3.2 抑制蝦類黑變的處理加工方法

3.2.1 常規(guī)處理方法 蒸煮、漂燙是食品中常用的殺菌、滅酶方法[60-61]。經(jīng)70～90℃熱處理能夠使酚氧化酶失活，起到較好的蝦類黑變抑制效果。但漂燙、蒸煮等熱處理會改變產(chǎn)品的顏色、風(fēng)味及質(zhì)地，還會使產(chǎn)品丟失維生素、糖及水溶性蛋白質(zhì)等可溶性營養(yǎng)成分。

低溫保藏方式如冷藏、冰溫[62]和凍藏[63]都能夠降低酚氧化酶的活性，進(jìn)而延緩蝦體的黑變，但不能使酶失活，當(dāng)恢復(fù)到室溫時，蝦體反而會加速黑變。

酶促反應(yīng)需要在自由水含量相對較高的環(huán)境中進(jìn)行，因此水分活度AW對于酶促反應(yīng)體系顯得十分重要。一般降低水分活度的方法有：添加持水劑和干燥技術(shù)。常見的持水劑有鹽、多元醇、糖等，用于降低自由水含量?，F(xiàn)在干燥技術(shù)中真空冷凍干燥技術(shù)被認(rèn)為是較有效的干燥方法，能在較低的溫度下去除水分，且對食品的品質(zhì)影響較小。但冷凍干燥后的樣品更易發(fā)生氧化，因此需結(jié)合包裝技術(shù)來提高作用效果。

3.2.2 高壓處理 高壓處理技術(shù)通過改變酶的空間結(jié)構(gòu)能夠使酶部分失活或全部失活。研究表明，超高壓處理不僅能夠降低微生物菌落數(shù)，延長新鮮凡納濱對蝦的貨架期，還能夠降低蝦體中酚氧化酶的活性[64-65]。但也有研究發(fā)現(xiàn)高壓處理促進(jìn)了蝦類黑變[66]，認(rèn)為這可能與壓強(qiáng)和處理時間有關(guān)。對比超高壓技術(shù)對多酚氧化酶提取物和食品介質(zhì)中酚氧化酶活力的影響研究發(fā)現(xiàn)[67]，食品介質(zhì)可能對酚氧化酶起保護(hù)作用，因此在實際應(yīng)用過程中需要更高的壓力和更長的處理時間來鈍化食品介質(zhì)中的酚氧化酶。

3.2.3 高密度二氧化碳處理 高密度二氧化碳是一種通過二氧化碳的分子效應(yīng)來達(dá)到殺菌和鈍化酶活效果的新型非熱加工技術(shù)，能夠在低溫條件下盡可能地保持食品的天然品質(zhì)和質(zhì)量安全[68]。研究表明，高密度二氧化碳處理通過破壞分子間作用力，改變酶的空間結(jié)構(gòu)，降低貯藏期間酚氧化酶的活力，從而抑制了蝦的黑變[69]。

3.2.4 高壓脈沖電場處理 高壓脈沖電場技術(shù)利用強(qiáng)電場脈沖來改變反應(yīng)體系的介電特性，從而降低酶的活性。在20℃下，經(jīng)過高壓脈沖電場（場強(qiáng)13～ 87kV/cm、0.5Hz，處理時間2μs）處理后，酚氧化酶的活力可降低30%～40%[70]。近幾年，在果蔬及果蔬汁等產(chǎn)品中應(yīng)用高壓脈沖場技術(shù)能夠達(dá)到鈍化酚氧化酶活性和防褐變的效果[71]，但在蝦類產(chǎn)品的應(yīng)用研究較少。

表2 部分植物來源的酪氨酸酶抑制劑Table 2 Tyrosinase inhibitors from different vegetablematerials

3.2.5 氣調(diào)包裝處理 氣調(diào)包裝技術(shù)通過調(diào)節(jié)包裝內(nèi)氣體的組分達(dá)到降低蝦類保藏過程中氧化反應(yīng)速率的目的。研究認(rèn)為[72]，低氧氣調(diào)包裝對蝦類黑變具有較好的抑制效果，高氧氣調(diào)包裝能夠促進(jìn)蝦的黑變。

4 討論與展望

近幾年，國內(nèi)外學(xué)者針對蝦類產(chǎn)品防黑變方法的研究進(jìn)行了許多有益的探討：a.在防黑變劑的開發(fā)方面，研究重點逐漸由單一化合物抑制黑變向復(fù)合黑變抑制劑協(xié)同作用的方向發(fā)生轉(zhuǎn)變；同時，隨著人們對食品安全的要求越來越高，化學(xué)黑變抑制劑逐漸被天然提取物所替代；b.在加工工藝方面，傳統(tǒng)熱加工技術(shù)已不能滿足人們對食品營養(yǎng)、感官品質(zhì)的要求，加工工藝逐漸向超高壓技術(shù)、高壓脈沖電場技術(shù)、氣調(diào)包裝等非熱加工處理技術(shù)轉(zhuǎn)變。

目前，研究普遍認(rèn)為蝦類黑變的發(fā)生主要與酚氧化酶有關(guān)，但相關(guān)研究者多集中在養(yǎng)殖過程中通過添加免疫激活劑來提高酚氧化酶活性，進(jìn)而提高蝦類養(yǎng)殖過程中免疫力方面的研究，而對于蝦類死后保藏過程中酚氧化酶如何被釋放、激活以及酶活的抑制機(jī)制是如何失效的研究報道較少。因此，結(jié)合蝦類保藏特點和目前蝦類黑變抑制技術(shù)的研究現(xiàn)狀，提出蝦類黑變抑制有以下研究方向：

a.應(yīng)用柵欄技術(shù)提高蝦類黑變抑制效果。復(fù)合多種黑變抑制劑或結(jié)合加工工藝，能夠提高單一黑變抑制劑或加工工藝抑制黑變的效果，并降低蝦類黑變抑制劑的使用劑量或加工處理強(qiáng)度，以滿足食品安全的要求。

b.深入研究活蝦酚氧化酶的調(diào)控機(jī)制，借鑒活蝦自身的酚氧化酶活性抑制機(jī)理，從酶促反應(yīng)的前饋和反饋控制方面進(jìn)行研究，模擬活蝦酚氧化酶的調(diào)控機(jī)制來人為干預(yù)蝦類死后酚氧化酶的活性調(diào)控，從而獲得蝦類黑變抑制的有效方法。

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Research progress inmelanosismechanism of shrim p products induced by phenoloxiade and the use of anti-melanosis techniques during preservation

QIAN Yun-fang，XIE Jing*，WUW en-hui
（Shanghai Engineering Research Center of Aquatic Product Processing&Preservation，College of Food Science and Technology，ShanghaiOcean University，Shanghai201306，China）

Melanosis in shrim p reduces the customers’accep tability d rastically，leading to the decreasing of market values and considerab le financial loss，which is triggered by a kind of enzymes called phenoloxidase. Phenoloxidase oxid izes tyrosine to quinine lead ing to b lack high molecular weight p igment.Studies on the mechanism s of phenoloxidase activation system and phenoloxidase inhibitory methods domestically and ab road were reviewed，in order to p rovide information for further study and development in shrimp p reservation techniques.

shrim p；melanosis；phenoloxidase；mechanism；anti-melanosis methods

TS254.1

A

1002-0306（2012）22-0400-06

2012－08－03 *通訊聯(lián)系人

錢韻芳（1985-），女，博士研究生，研究方向：食品保鮮。

“十二五”國家支撐計劃項目（2012BAD29B06）；教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金（20113104110005）；上海市科委工程中心建設(shè)（11DZ2280300）。